Mekanisk Manipulation av nervceller till Control axonal utveckling

Summary

Ansökan och direkta mätningar av krafter på nervceller i 2-1000 microdyne utbud uppnås med hög precision med kalibrerad glas nålar. Denna metod kan användas för att kontrollera och mäta flera aspekter av axonal utveckling, inklusive axonal initiering, axonal spänning, hastighet axonal töjning, och vektorer kraft.

Abstract

Cell manipulationer och utbyggnad av neuronala axoner kan uppnås med kalibrerad glas mikro-fibrer som kan mäta och tillämpa krafter i 1-10 μdyne intervallet ^1,2. Force mätningarna erhålls genom observation av Hookean böjning av glas nålar, som är kalibrerade av ett direkt och empirisk metod ^3. Utrustning krav och förfaranden för att tillverka, kalibrering, behandla och använda nålar på celler är helt beskrivs. Kraften regimer som tidigare användes och olika celltyper som dessa tekniker har tillämpats demonstrera flexibiliteten i metodik och ges som exempel för framtida utredning ^4-6. De tekniska fördelarna är den kontinuerliga "visualisering" av de krafter som produceras av manipulationer och möjlighet att direkt ingripa i en mängd av cellulära händelser. Dessa inkluderar direkt stimulering och reglering av axonal tillväxt och retraktion ^7, samt avskildhet och mekaniska mätningar på alla typer av odlade celler ^8.

Protocol

1. Göra glas nålar.

1. En justerbar micro-nål avdragare används för att tillverka nålar med ett avsmalnande spets ca 4 mm i längd och som är stängda fasta balkar. I motsats till en lång, böjlig spets, begränsar denna korta 4 mm längd vibrationer nålspetsen under experiment. Vid proximala region 4 mm fiber, vaxljus nålen snabbt från diameter glasrör till 15 ìm inom 1 mm, medan den distala-högst 1 mm av fiber är 2,5 mikrometer i diameter. Vi använder R-6 glas kapillärrör, OD 0,9 mm, ID 0,6 mm 8 "längd och en BB-CH avdragare. Om utredaren är intresserad av att mäta andra gällande sortiment, nålar med olika fjäder egenskaper (det vill säga med en annan längd och eller tjocklek) ska dras. Varje kapillärrör drar i fyra 2 "nålar. Nålar lagras i täckta 160 mm petriskålar med två modellera "ormar" i vilka nålar är lätt intryckt.
2. Glaset nålar, samt en tråd som ska beskrivas, i huvudsak balkar används som böjning fjädrar av lämpliga styvhet för önskad mätning av kraft. Observera att böja kraft en balk skalor som kuben av dess längd, oavsett sammansättning. Således, för någon av kalibrering steg som beskrivs nedan, kan en nål / stråle av otillräcklig styvhet göras styvare med en liten mängd matfett (t.ex. en 10% kortare producerar en 28% ökning av styvheten, dvs 0,9 ^3).

2. Ringa och kalibrering av en tråd

1. Gör en nål tråd kalibrering genom att sätta in en 0,001 "Chromel tråd genom insidan av ett glas nål (som görs i avsnitt 1.1) med spetsen avbruten. Drag wiren ur tips till en längd av 26 mm och limma den på plats med superlim. Böj distala 1 mm av kabeln i en krok.
2. Gör mikro-vikter från 1 meters 0,003 "konstantan tråd. Att mäta tråd, band den till en meter pinne att hjälpa till att få det rakt som möjligt. Väg 1 m tråd, exakt klippa till 1 cm bitar och böj flera stycken i Vs
3. Kalibrera wire nålar kräver en dissekera mikroskop med en mätning av riktmedel och en mikromanipulator. Mikroskopet lutar 90 ° på sin sida med hjälp av en universell bom stativ, så att en nedåtgående omläggning av kabeln nålen kan observeras. Montera kabeln nål i avsnitt 2,1 i en verktygshållare på en mikromanipulator så att hooked regionen är vinkelrät mot den optiska axeln i mikroskop. Rada upp kroken av kabeln nålen med ett riktmedel märke. Häng 1 cm mikro-vikt på kroken och registrera deformationen. Det böjliga konstant (μdynes / mikrometer) av hänvisningen tråd beräknas som förhållandet mellan mikro-vikt (notera: 1 mg = 0,98 dynes) dividerat med det observerade nedböjning (mikrometer). För att förbereda Tråd för nästa steg, skär bort kroken på den väger punkt med en skalpell. Förekomsten av kroken är extra vikt som böjer kabeln till en liten grad. Således effekter utgångsläget av kabeln i riktmedlet innan vikten läggs till. Mätningen av kabeln fjäderkonstanten kommer från wirens utslag när vikten läggs till i böja punkt (framtida spets tråd). När kroken är avskuren det inte ändrar fjäderkonstanten av kabeln.

3. Kalibrera mellanliggande glaset nålar

1. Kalibrering av mellanliggande glaset nålar kräver användning av ett inverterat mikroskop med en okulär riktmedel. På ena sidan av mikroskopet scenen är en mekanisk mikromanipulator används för att hålla vajern nål i avsnitt 2 i mitten av den optiska området. Å andra sidan är en treaxlig hydraulisk mikromanipulator (se utrustning tabell) används för att flytta den mellanliggande glasnål vara kalibrerad. Använda micromanipulators, ta med både barr tillsammans i mitten av den optiska området på en ~ 45 ° vinkel i ett 160 mm x 30 mm petriskål med vatten i en 10x fält.
2. En serie nålar drog med olika inställningar på pipetten avdragare är först genereras för utvärdering. Målet är att göra en mellanliggande glas nål med en böjning fjäderkonstanten på 20-30 μdynes / ìm. Fastställande av styvhet görs genom att mäta förhållandet mellan omläggning av de mellanliggande nålen jämfört med omläggning av kabeln nålen. Till exempel med tråd och glas nålar beröring, är glaset nålen flyttade till avleda tråden nålen ett avstånd av 5 märken på riktmedlet sett genom ögonen bitar. Flytta glasnål sidled kopplar ur nålar. Tråden nål återgår sedan till sitt ursprungliga startposition, men glaset nålen kommer nu att vara i en ny position. Belastningen på glasnål beräknas sedan från sin nya noll-kraft minus ställning både nålar på lika kraft last (både barr engagerade). I det här exemplet, om båda nålar böjs för att markera 5 (från noll på riktmedel), kommer kabeln nålen gå tillbaka till noll medan GLAss nål kanske våren till 25, i så fall, böjde det 20 märken med samma kraft som spände vajern nål 5 märken. Därför ger förhållandet böjning mellan de två nålar kalibrering av glas nål och det är ¼ stel som tråden nål. Eftersom fjäderkonstant beräkningar i avsnitt 3.4 används proportionerna av sträckor de är oberoende av förstoring eller riktmedel division storlek. Den enda begränsande faktor är att deformationen är tillräckligt små för att vara i linjärt elastiska området av nålar.
3. Gör en serie av nedböjningar vid positioner 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 märken på riktmedlet. Om någon nedböjningar släppa förtid upprepa dem. Mellan nedböjningar hålla tråden nålen justeras till noll. För varje av dessa nedböjningar, notera hur mycket avlänkade och den slutliga noll-last position glaset nålen efter release. Detta skapar 10 par datapunkter. Andra sekvenser kan användas, men denna serie har utformats för att ge tidiga indikationer på intern konsistens, linjäritet och hysteres (resultat av nedböjningar 5 + 10 = 15, 3 +7 = 10, den 5,10,15 deformationen efter frigivningen bör vara ungefär samma i början och slutet).
4. Linjär regression av de registrerade nedböjningar från avsnitt 3.3 ger en mer exakt kvantifiering av böjning konstant mellanliggande glasnål än en omläggning förhållande. Det ger också en bedömning av linjäritet nålen och kvaliteten på kalibreringen indikeras av ett högre R-värde och närheten till fånga och regressionslinjen till noll. För att förbereda de 10 uppgifter par från avsnitt 3.3 för regression måste den andra antalet registrerade par, det sista noll-last position glaset nålen efter release, har motsvarande initiala deformationen subtraheras från det, vilket är det första numret av paret. När denna funktion utförs en uppsättning nya antalet par består av den ursprungliga böjning och motsvarande skillnaden beräknas. Tillsätt 5 kontroll par 0,0 till dessa 10 experimentella data par för att förankra linjär regression på noll kraft för noll böjning. Detta är inte absolut nödvändigt, men ger en extra grad av noggrannhet. Ankring på 0,0 bygger på principen att nålen inte är böjd när kraft inte tillämpas. Med dessa 15 uppgifter parvis beräkna en linjär regression. Det böjliga fjäderkonstant av glaset nålen är kalibrerad är kabeln nålen kända böjer konstant delat med lutningskoefficienten för denna regressionslinje.

4. Kalibrera bearbetning av glas nål används för att manipulera nervceller

1. Glas nålar av tillräcklig efterlevnad, 2-15 μdynes / ìm, används experimentellt på nervceller är kalibrerad mot den mellanliggande glaset nål i en motsvarande sätt som beskrivs i avsnitt 3. Det vill säga, kandidaten arbetar nålar avleda en mellanliggande nål av kända stelhet placeras i den position av kabeln nål i avsnitt 3. Glas nålar på mindre än två μdynes / ìm kan kortas något för att få dem i rätt styvhet sortiment.

5. Nålar förbehandlas med fäste faktorer

1. Nålar som ska behandlas trycks in i sidan av en lerklump som hölls i en klämma in över en 10 ml bägare för attachment faktor lösning, så att bara toppen av nålen är nedsänkt i lösningen. Doppa kapillärröret axeln är inte önskvärt eftersom det ökar ansamling av beläggningen på spetsen över tiden, vilket ändrar styvhet och minskar nålens effekten av bilaga. En kalibrerad nål kan användas endast ca 4 gånger och kan kalibreras för noggrannhet. Nålarna doppas sekventiellt i 0,1% polylysine lösning i 30 minuter och sedan concanavalin A (1 mg / ml i PBS) i 30 minuter. Den polylysine kan användas upprepade gånger i flera veckor och förvaras vid -20 ° C. Gör Cona färska varje vecka och förvaras vid 4 ° C. För andra celltyper att molekylerna presenteras ytan genom nålen får direkt samband med den utredningen.

6. Utrustning upprätta

1. Den bogsering arbete stationen är inställd på en vibrationsisolering bord. Den består av ett inverterat mikroskop utrustat med en bar på vänster ovanför scenen och en hydraulisk manipulator fäst vid den, hålla våra uppvägs anpassade förlängning, i vilken dubbla verktygshållaren är isatt. Placera hydrauliska mikromanipulator längs baren, genom att sätta en nål i hållaren i mikroskop ljus väg, medan manipulator reglage är centrerade i sina sortiment. På den tiden nålen behandlas med kvarstad faktorer, slå på Ringcubator eller andra mikroskop skede värmesystem, så scenen är på termisk jämvikt i början av försöken.

7. Justera nålar

1. Målet är att få de två nålar (i referens-och arbetsgrupper nål) i mikroskop synfält ordnas såderas tips är ca 50 ìm isär, isär, med referens ovanför kulturen skålen, därför något ofokuserad när bogsering nålen är i fokus på skålen. De två nålar i sin nål hållare är monterade i en Leica dubbel-verktygshållare, som själv är en liten mikromanipulator. Använda mikromanipulation av dubbel-verktygshållare, är de två tips tas i parallella justering. Sätt referens nålen i en nål bara en kort bit, nog för att dra åt kragen att greppa den och placera denna församling i högra sidan av den dubbla hållare. Sätt den behandlade arbetar nålen halva sin längd i nål och placera den i den vänstra sidan av den dubbla hållare. När de två nålar tips förs till samma framåt position och ställde upp, de olika längder på nålar i deras hållare stappla de kragar så att de inte hindrar att få tips mycket nära varandra. Avsnitten 7,2 igenom 7,4 sker utan förstoring. Avsnitten 7,5-7,8 görs under mikroskopisk observation.
2. Förinställda den hydrauliska mikromanipulator så den vertikala kontrollen hela vägen upp. Ställ in andra kontroller till mitten av sitt sortiment, och även framåt / bakåt skruv i hållaren.
3. Ta med två nålar tips ihop med hjälp av den från sida till sida justerskruven på högra sidan av hållaren. Tryck sedan in nålen Företagarna själva framåt eller bakåt i den dubbla verktygshållare som behövs för att föra nålen tips till samma framåt position. Undersök paret från sidan och använda rätt sida upp / ner skruven för att få tips i samma plan. Rotera nål aktieägare i verktygshållaren för att minska klyftan om en nål vinklar i sin nål.
4. Swing verktygshållaren och placera tips i ljusstrålen ovanför media, sportfiske ner dem kraftigt. Dra åt kulleden skruven vid basen innan du flyttar din hand bort.
5. Hitta din nål tips i mikroskop synfält innan du tar dem för långt ner och bryta dem eller foul dem med skräp på botten av kulturen skålen. I en 60 mm maträtt, ger 15 ml medium tillräckligt djup för en säkerhetsmarginal över skålen botten. Gör en första praktiken med en okalibrerade nål för att få känna av detta steg. Börja med att fokusera uppåt ovanför cellerna på botten av skålen med a10x mål. Gör detta i ett område av skålen från ljuskänslig eller experimentella celler. Sänk nålar i media. Flytta nålar sida till sida efter sin skugga. Om du inte ser dem, sänka dem lite och flytta dem framåt i skålen, upprepa från sida till sida passera. Hitta spetsen, genom att flytta tillbaka (eller framåt) och ner.
6. Vrid från sida till sida skruv för att se vilka nål du har hittat. Om det rör sig med skruven som du tittar på referensen nålen, om det inte är det kalibrerade nålen. För kalibrerad nålen, använd sida till sida skruva att driva referens nålen mot det. Flytta den fram och tillbaka efter referensen skugga. Om det är referensen nålen du har hittat, skruva det åt vänster medan du flyttar hydrauliska till höger letar efter kalibrerade nålen.
7. När båda nålar finns att använda fina kontroller av dubbla verktygshållaren att rada upp dem. Den branta vinkeln på nålar komma över kanten på skålen gör upp / ner-kontroll att även ha en forward, förlänga komponent till uppräkning och en förkortning med ner. Den vänstra sidan, framåt / bakåt skruv kontroll har det motsatta, driver tippa framåt är också ner i skålen, drar tillbaka dra tillbaka nålen samtidigt höja spetsen ståndpunkt. Därför kommer höja referens och driva de kalibrerade nålen förlänga både att göra dem ännu på tips samtidigt som fört in dem till optimala förhållandet mellan höjd över skålen. Om referensen nålen sträcker sig långt bortom de arbetande nålen kan du skruva / trycka arbetsmiljön nålen ner och framåt samtidigt svänga referens ner och förkorta den tills de två är jämna och de arbetande nålen är lägre. Ibland skruvarna området inte kommer att föra nålar tillsammans, så du kan behöva för att försiktigt glida innehavarna själva, se till att kulleden skruven är väl åtdragna och använda fingrarna kilas fast mot kanten av verktygshållaren att tillämpa våld för att skjuta axlar. Du kan också rotera nålen innehavare i verktygshållare som tidigare, medan upp i media och observera effekten, se om de får närmare varandra.
8. Spela in bilden av denna slutliga justerade positionen, är separationen av nålar utan kraft tillämpade nollreferens avstånd. Höj nålar ovanför provet planet och "parkera" dem i kanten av synfältet.
9. Skräp på en nål kan tas bort genom att höja den genom menisken. Först flytta referens nålen bort från den andra nålen för att undvika de två tips självhållning på varandra. Flera pass kan vara nödvändig.
</ Ol>

8. Ansluta till celler

1. Till denna punkt, har nålar observerats direkt genom mikroskop. Från och med cellbindning kommer observationer att göras både genom mikroskop och på videoskärm. Vänster / höger sida av båda är identiska, men de upp / ner orientering av bilden på bildskärmen är inte detsamma som (gravitation) upp och ner på mikroskopet. För att tydliggöra skillnaderna mellan upp / ner riktningar som observeras direkt genom mikroskop och som observerats på video-skärmen, kommer den senare att kallas "upp" och "ner", dvs inom citationstecken
2. Processen för bogsering sker genom att ändra placeringen av två nålar från vänster till höger ("horisontella") på videoskärm. Därför är valet av experimentella axonet gjorde delvis på axonet sträcker sig i samma "horisontella" riktning. Axonet kan avvika "nedåt" från "horisontell" med så mycket som 15 °, eftersom detta kommer att kompenseras av "push up" manöver i avsnitt 8.5. Dessutom bör axonet valts för manipulation vara en cell kroppens längd eller mer, med en aktiv tillväxt kotte. Axoner sträcker sig till höger om cellkroppen är att föredra på grund av inrättandet av den dubbla verktygshållaren med arbetsnamnet nål monterad till vänster om referensen nålen, vidgas så att tillämpas spänningar under bogsering gapet mellan de två nålar.
3. Ett utmärkt axon som sträcker sig till vänster i cellen kroppen kan dras utan att omorientera den dubbla verktygshållare som inrättats av att klyftan mellan nålar och höja referens nålen lite. Detta gör att bogsering nålen mer utrymme att flexa mot referens-och passera under den vid behov. Den bogsering kommer sedan vidare till vänster och bogsering nålen böjer sig mot referensen nålen som spänning ökar. Vid analys av de data som denna förändring i förhållandet mellan spänning till referensavstånd matas in i kalkylbladet genom att subtrahera mätningen nålen separation från noll referensavstånd i stället för noll avstånd från mätningen.
4. Flytta nålar nära tillväxten konen på axonet, registrera noll distans igen, höja nålar, och luft upp vibrationsisolering bordet.
5. Helt enkelt sätta att arbeta nål framför en framåt tillväxt konen kan ge spontana kvarstad den snabba tillväxten konen. Att aktivt manipulera en bilaga till tillväxten konen, placera bogsering nålen ner "under" tillväxt konen och sedan sänka nålen mot skålen botten. Detta gör att nålen att avleda "upp", böjning och glider längs skålen i tillväxt konen, lossnar den och flytta den "uppåt". Tryck nålen mot skålens botten bara tillräckligt så att tillväxten konen krokarna kring nålspetsen, men inte så långt att det glider över nålen och diabilder bakåt. Vänta 20 minuter för att låta ett grepp etableras. Med erfarenhet kan framgång vara så hög som 90%, men är mer normalt i 75% intervallet. Först framgång kan vara närmare 25%. Den främsta fallgropen när du börjar är att "över manipulera" tillväxten konen. Den inledande interaktion i den "push-up steg" tar några sekunder. Tillväxten konen ska sedan lämnas ensamma för att bilda en stabil infästning. Då tålamod måste utövas under följande steg.
6. När tillväxten konen är på nålen, sätt en liten spänning på det genom att flytta nålar till höger, och höja nålen lite. Kompensera för nålen gå "nedåt" genom att flytta nålen framåt lite samtidigt höja. Höj i etapper tills du har den bifogade processen sträcker sig vinkelrätt från nålen och ovanför skålen. Den vinkelräta placering av axon som sträcker sig från barren när bogsering har påbörjats krävs för noggrann kraft mätningar, dvs så att den enda verkande kraften vektorn är längs axeln av axonet. Om den dragna processen vinklar bort från nålen, är en vektor av kraften född längs axeln av nålen snarare än att böja nålen och den totala kraften är inte mäts. Komma bort från platsen av den första skålen bifogade förbättrar förutsättningarna för en varaktig anknytning till nålen. Spetsen kan vara ovanför skålen (sett i små vibrationer eller ett annat plan av fokus från skålen) eller vidröra den med minimal kraft. För mycket dra på ytan kommer att förvränga mätningar. En nål att hålla sig till skålen eller cell process Sätta tillbaka till underlaget kommer att leda till kraftbelastning om du fortsätter att försöka flytta den, som sedan plötsligt "poppar loss" med eventuell förlust av den bifogade filen. Att befria nålen från en sådan stötesten, flytta nålen fram och tillbaka ("upp" och "ner" i planet på skärmen) istället för att lägga mer kraft (höger).

9. Utöka ett axon eller cell-processen

1. Bogsering sker med hjälp av små steg av våld genom att flytta nålar bort från cellkroppen. Krafter observationved som ett ökande gap mellan nålar. Medan gradvis öka spänningen, noga följa efter tecken på avlossning av tillväxten konen från nålen.
2. Om tillväxten konen lossnar och är inte snabbt dra tillbaka, minska spänningen en aning och vänta, ofta tillväxten konen kommer att "fånga upp" och ta ut nålen igen. Om axonet lossnar nålen fånga det innan det dras in genom att fånga den mot skålen med nålen och upprepa "driva upp" eller en "pull down" för att sätta lite spänning på den och vänta ca 10 min för ny infästning . Efter två misslyckade försök, rekommenderar vi att du använder en annan cell.
3. Bibehåll media nivå i fatet genom att tillsätta vatten per timme för att motverka avdunstning, med hjälp av ett märke på sidan av skålen för att visa den inledande djup. Med en lång pasteurpipett, långsamt tillsätt vatten vid sidan av skålen bort från nålar. Förlängning av en process som ofta "stånd" om medierna blir hyperosmotic. Avdunstning kunde minskas med olja beläggning mediets yta men detta måste läggas efter nålen i media. Om nålen passerar genom olja, är tillväxten konen mycket mindre sannolikt att fästa nålen.
4. I slutet av ett experiment, innan du lyfter nålar ur skålen, kontrollera noll avstånd.

10. Data Analysis

1. Läs positioner nålar längs en vågrät axel på skärmen, placeringen av cellkroppen och tider rekord. Det avstånd på nålar minus lossas noll avståndet multiplicerat med böjning konstant för nålen är lika med μdynes i kraft tillämpas. Kalibrera avstånd skärmbilden med hjälp av en objektmikrometern.
2. Mycket viktigt för kvalitet data är att säkerställa referensavstånd (noll kraft) avståndet mellan barren ändras inte under experimentet. Termiska förändringar kommer att påverka utrustningen på micron skala, vänder alltså inte på luftkonditioneringen under ett experiment. Även om ditt mikroskop värmesystem har en fördröjning vänta tills du har termisk stabilitet. Den Ringcubator minskar fördröjning och även isolerar den termiska förändringar i skålen från resten av mikroskop och manipulation systemet minskar termiska Nollpunktsavvikelsen och förändringar i fokus. En annan kraft ändra nålens obelastad separation är ytspänning på nålen axlar. Belastningen ändras med djupet i vätskan i skålen. Kontroll av referensavstånd genom att säkerhetskopiera nålar och tillfälligt ser ingen kraft noll distans då och då under ett experiment förbättrar kvaliteten på uppgifterna, även om du är att notera en förändring i separationen.

11. Representativa resultat:

Kraft-kalibrerade glas nålar lätt kan tillämpas på alla cellulära region, vanligtvis tillväxten konen, som visualiseras direkt av ljusmikroskop. Med lämplig behandling av nålen för att få cellulära bifogad fil kan mekaniska spänningar vara experimentellt tillämpas på cellulär regionen av intresse, eller de krafter som produceras av denna region kan mätas. En representant neuronala bogsering experiment visas i figur 1, där bogseras axonet har fördubblats i längd på två timmar.


Figur 1. En kultiverad kyckling dorsala ganglion cell med önskad inriktning för bogsering är vald. Den initiala nollreferens avstånd mellan nålar registreras innan den experimentella manipulation börjar (A). Den "driva upp" manöver används för tillväxten konen (B). Bogsering börjar med ökad kraft belastning vilket framgår av den separation av nålar (C). Bogsering har förlängt axonet har "horisontell" och vinkelrät anpassningar av bogseras axon och arbetar nål underlättas god kraft mätningar (D). Bar = 40 ìm. Nål kalibrering = 6,9 μdyne / ìm.

Discussion

Tekniker för att tillämpa och mäta cellulära krafter har en lång historia ^9. Vår metod var ursprungligen motiverades av arbete Dennis Bray, som använde glas nålar liknar vår att "bogsera" nervceller med en konstant hastighet med hjälp av en motordriven hydraulisk enhet ^10. Det finns många alternativa sätt att tillämpa krafter till celler som inkluderar: stegmotorer ^11, magnetiska kulor ^12, mikrofabricerade balkar ¹³ och flöden vätska ^14. De senare liknar vår strategi att cellulära proben är ytterst kalibreras mot en böjning stråle av kända styvhet och de cellulära mätningar beror på optiska mikroskopiska observationer. I jämförelse med andra metoder, är den främsta fördelen med vår metod ³ förmågan att samtidigt tillämpa och mäta krafter i μdyne sortiment med utrustning (mikroskop och micromanipulators) typiska avdelningar life science.

Genom att använda dessa metoder, eftersom de krafter som utövas av neuronala tillväxt kottar de framsteg har mätts ^15. Den mekaniska relation axonal töjning takt till följd av spänningar har bestämt sig för att följa en Newtonsk fluid-liknande stimulus-respons förhållande ^7. Den relativa känslighet axoner som svar på spänning har visats vara större för centralt hjärnans neuroner än för perifera nervceller i kycklingen embryot ^2. Indragning av axoner har också undersökts ^7. Nervceller med någon bestämd axoner kan ha sina axonal / dendritiska polaritet kontrolleras genom tillämpning av mekaniska spänningar ^5. I fibroblaster uttrycker GFP-märkta aktin och tubulin, visualiserade vi direkt respons cytoskelettet till enkla fastsättning av nålen och dess svar på förändringar av spänning ^8. Cell bilagor till varandra eller substrat har testats ^1. Den framåtdrivande krafter rörliga celler kan undersökas och dra närmar filipodia kunde mätas ^16. De motioner som visas av märkt mitokondrier inom bogseras axoner har använts för att modellera intern transport av material (låg hastighet transport) och bestämma att nervceller växer med intercalated massa tillägg längs den axonal axeln ^6,17.

För utredarna helt enkelt intresserad av att söka krafter utan att mäta dem, är användningen av hänvisningen nålen inte krävs ^18. Om däremot kraft mätningar önskas referensen nålen är viktigt att generera korrekta uppgifter. Sammantaget räknar vi felet i den absoluta kraft mätningar i intervallet 5% till 10% med den största felkällan uppkommer i data läsprocessen. Svårigheten är just att identifiera platsen för defocused referens nål och minimera effekterna av små och tillbaka rörelser (vibrationer) av nålar. Utan en referens nål, skulle dessa felkällor vara ännu större.

Experimentella manipulationer behöver inte sluta med bogsering sessionen. Bogseras tillväxt koner kan kopplas till andra celler eller anbringas på nytt till skålen ^5. Med hjälp av denna manipulativa möjlighet, kan neuronala mikro-circutry avsiktligt konfigureras så att överhörning av olika celltyper som skall undersökas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
R-6 cap. Tube	Drummond Scientific	9-000-3111	R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8"
BB-CH puller	Mecanex S.A., Geneva, Switzerland	BB-CH puller	Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000
0.001" Chromel wire	Omega Engineering, Inc.	SPCH-001-50	unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega
0.003" Constatan wire	Omega Engineering, Inc.	SPCI-003-50	unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool
fine forceps	Fine Science Tools	91150-20	Dumont Inox #5
universal microscope boom stand	Nikon Instruments	76135 or 90430	most brands or types of boom stand will work for this use
mechanical micromanipulator	Narishige International	M-152	three-axis direct-drive coarse micromanipulator
hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-203	now available as MMO-203, three movable axis type
needle holder	Leica Microsystems	11520145	set of 3
single instrument holder	Leica Microsystems	11520142
double instrument holder	Leica Microsystems	11520143
mechanical micromanipulator	Leica Microsystems	39430001	post mount,1 prob holder, RH Model 430001
joystick mech. micromanipulator	Leica Microsystems	11520137
Leica DM IRB	Leica Microsystems		inverted microscope
Vibraplane isolation table	Kinetic Systems	1200 series	ours is model 1201-02-12
Ringcubator	Home made (see reference 19)		reference 19, requires updated controller listed below
programable temperature controller	Instrumart.com	Fuji Electric PXR3	replaces the retired PXV3 temperature controller
Nikon Diaphot TMD	Nikon Instruments		inverted microscope, circa 1980
Nikon SMZ-10 binocular dissecting	Nikon Instruments		other dissecting microscopes will work