Summary
Toepassing en directe metingen van de krachten op neuronen in de 2-1000 microdyne serie worden bereikt met een hoge precisie met geijkte glas naalden. Deze methodiek kan gebruikt worden om de controle en meten van verschillende aspecten van axonale ontwikkeling, waaronder axonale initiatie, axonale spanning, snelheid van axonale rek, en kracht vectoren.
Abstract
Cel manipulaties en uitbreiding van de neuronale axonen kan worden bereikt met gekalibreerde glazen micro-vezels geschikt voor het meten en toepassen van krachten in van 10-1000 μdyne range 1,2. Force metingen worden verkregen door observatie van de Hookean buigen van het glas naalden, die worden gekalibreerd door een directe en empirische methode 3. Apparatuur eisen en procedures voor het fabriceren, kalibreren, behandelen, en het gebruik van de naalden op cellen worden volledig beschreven. De kracht regimes eerder gebruikte en de verschillende celtypes waarop deze technieken zijn toegepast tonen de flexibiliteit van de methodologie en worden gegeven als voorbeelden voor toekomstig onderzoek 4-6. De technische voordelen zijn de continue 'visualisatie' van de krachten die door de manipulaties en de mogelijkheid om rechtstreeks in te grijpen in een verscheidenheid van cellulaire gebeurtenissen. Deze omvatten directe stimulatie en regulering van de axonale groei en terugtrekking 7, evenals onthechting en mechanische metingen op elk type van de gekweekte cellen 8.
Protocol
1. Het maken van glas naalden.
- Een verstelbaar micro-naald trekker wordt gebruikt om naalden te fabriceren met een taps toelopende tip over 4 mm in lengte en die zijn gesloten solide balken. In tegenstelling tot een lange flexibele tip, deze korte 4 mm lengte beperkt trillingen van de naaldpunt tijdens de experimenten. Aan het proximale gebied van de 4 mm vezel, de naald versmalt snel van de diameter van de glazen buizen tot 15 micrometer binnen 1 mm, terwijl de distale meest 1 mm van de vezel is 2,5 micrometer in diameter. We maken gebruik van R-6 glazen capillaire buis, OD 0.9 mm, 0.6 mm ID 8 "lengte en een BB-CH trekker. Als de onderzoeker geïnteresseerd is in het meten van andere kracht bereiken, naalden met verschillende eigenschappen veer (dat wil zeggen van een verschillende lengte-en of dikte) moet worden getrokken. Iedere capillair trekt in vier 2 "naalden. Naalden zijn opgeslagen in overdekte 160 mm petrischaaltjes met 'slangen' twee klei waarin de naalden licht worden ingedrukt.
- De glazen naalden, evenals van een naald te worden beschreven, zijn in wezen balken gebruikt als buigveren van de juiste stijfheid voor de gewenste metingen van kracht. Merk op dat de buigkracht van een balk schalen als de kubus van zijn lengte, ongeacht de samenstelling. Dus voor een van de kalibratie hieronder beschreven stappen, kan een naald / breedte van onvoldoende stijfheid worden gemaakt stijver door een kleine hoeveelheid van de verkorting (bijvoorbeeld een 10% verkorten produceert een 28% toename van de stijfheid, dat wil zeggen 0,9 3).
2. Het maken en kalibreren van een naald
- Maak een draad kalibratie naald door het invoegen van een 0.001 "chromel draad door de binnenkant van een glazen naald (gemaakt in paragraaf 1.1) met de punt afgebroken. Trek de draad uit de punt tot een lengte van 26 mm en lijm het vast met superlijm. Buig het distale 1 mm van de draad in een haak.
- Maak micro-gewichten van 1 meter van de 0.003 "constantaan draad. Om de draad, tape naar een meter stok om te helpen bij het krijgen van het recht mogelijk. Meten Weeg de 1 m van de draad, nauwkeurig snij het tot 1 cm stukken, en buig verschillende stukken in de Vs
- Kalibreren van de draad naalden vereist een dissectie microscoop met een meet-dradenkruis en een micromanipulator. De microscoop is 90 ° gekanteld op zijn kant met behulp van een universele boom staan, zodanig dat een neerwaartse afbuiging van de draad naald kan worden waargenomen. Monteer de draad naald van punt 2.1 in een instrument houder op een micromanipulator zodanig dat de aangesloten regio loodrecht op de optische as van de microscoop. Line-up de haak van de draad naald met een dradenkruis te markeren. Hang de 1 cm micro-gewicht op de haak en noteer de doorbuiging. Het buigen constante (μdynes / pm) van de referentie-draad is berekend als de verhouding van de micro-gewicht (let op: 1 mg = 0,98 dynes) gedeeld door de waargenomen doorbuiging (pm). Ter voorbereiding op de draad naald voor de volgende stap, afgesneden van de haak bij de weging punt met een scalpel. De aanwezigheid van de haak is extra gewicht dat buigt de draad in geringe mate. Zo effecten van de eerste positie van de draad in het dradenkruis voordat het gewicht wordt toegevoegd. De meting van de draad veerconstante is afgeleid van doorbuiging van de draad is wanneer het gewicht wordt toegevoegd aan de bocht punt (toekomstige uiteinde van de draad). Wanneer de haak wordt afgesneden het verandert niets aan de veerconstante van de draad.
3. Het kalibreren van de tussenliggende glazen naalden
- Kalibratie van de tussenliggende glazen naalden vereist het gebruik van een omgekeerde microscoop met een oculair dradenkruis. Aan de ene kant van de microscoop podium is een mechanische micromanipulator gebruikt om de draad naald van deel 2 te houden in het centrum van het optische veld. Aan de andere kant is een drie-assige hydraulische micromanipulator (zie tabel apparatuur) gebruikt om de tussenliggende glazen naald wordt gekalibreerd te verplaatsen. Met behulp van de micromanipulators, brengen beide naalden samen in het midden van het optische veld op een ~ hoek van 45 ° in een 160 mm x 30 mm petrischaal van water in een 10x veld.
- Een reeks van naalden getrokken met verschillende instellingen op de pipet trekker worden eerst gegenereerd voor de evaluatie. Het doel is om een intermediair glazen naald te maken met een buiging veerconstante van 20-30 μdynes / um. Bepaling van de stijfheid wordt gedaan door het meten van de verhouding van de afbuiging van de tussenliggende naald in vergelijking met de doorbuiging van de draad naald. Bijvoorbeeld, met de draad en glas naalden aan te raken, is het glas naald verplaatst naar de draad naald buigen op een afstand van 5 punten op het dradenkruis zoals gezien door het oog stukken. Het verplaatsen van de glazen naald zijdelings schakelt de naalden. De draad naald keert vervolgens terug naar zijn oorspronkelijke startpositie, maar het glas naald wordt nu in een nieuwe positie. De belasting op het glas naald wordt dan berekend uit de nieuwe nul-kracht minus de positie van beide naalden bij gelijke kracht belasting (beide naalden ingeschakeld). In dit voorbeeld, als beide naalden worden afgebogen tot 5 (van nul op het dradenkruis) merk, zal de draad naald terug te gaan naar nul, terwijl de GLAss naald kan de lente tot de 25, indien dat zo is, 20 punten gebogen met dezelfde kracht, dat de draad naald 5 punten gebogen. Daarom is de verhouding van het buigen tussen de twee naalden geeft de kalibratie van het glas naald en het is ¼ zo stijf als de draad naald. Omdat de veerconstante de berekeningen in paragraaf 3.4 gebruik verhoudingen van de afstanden zijn ze onafhankelijk van vergroting of dradenkruis divisie grootte. De enige beperking van overweging is dat de doorbuiging zijn klein genoeg om te worden in de lineaire elastische bereik van de naalden.
- Doe een reeks van vervormingen op de posities van de 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 markeringen op het dradenkruis. Als er vervormingen vrij vroeg te herhalen die. Tussen vervormingen houden de draad naald uitgelijnd op nul. Voor elk van deze doorbuigingen, let afgebogen het bedrag en de laatste nul-belasting positie van het glas naald na de release. Dit leidt tot 10 paren van gegevens punten. Andere sequenties kunnen worden gebruikt, maar deze serie is ontworpen om vroege tekenen van interne consistentie, lineariteit en hysteresis (resultaten van doorbuigingen 5 + 10 = 15 te geven; 3 +7 = 10; de 5,10,15 doorbuigingen na de release moet ongeveer hetzelfde aan het begin en einde).
- Lineaire regressie van de opgenomen doorbuigingen van paragraaf 3.3 geeft een meer accurate kwantificering van de constante buigen van de tussenliggende glazen naald dan een afbuiging ratio. Het biedt ook een evaluatie van de lineariteit van de naald en de kwaliteit van de kalibratie wordt aangegeven door een hogere R-waarde en de nabijheid van de intercept van de regressielijn tot nul. Ter voorbereiding op de 10 paren gegevens uit sectie 3.3 voor de regressie, moet het tweede nummer van de geregistreerde paren, de laatste nul-belasting positie van het glas naald na de release zijn de desbetreffende eerste afbuiging afgetrokken van het, dat is het eerste nummer van het paar. Zodra deze operatie is uitgevoerd de set van nieuwe aantal paren bestaan van de eerste doorbuiging en de bijbehorende verschil berekend. Voeg 5 controle paren van 0,0 tot deze 10 experimentele gegevens paren om de lineaire regressie anker op nul kracht voor nul doorbuiging. Dit is niet absoluut nodig is, maar voegt een extra graad van nauwkeurigheid. Verankering van 0,0 is gebaseerd op het principe dat de naald niet wordt gebogen wanneer kracht wordt niet toegepast. Met deze 15 paren gegevens berekent een lineaire regressie. Het buigen veerconstante van het glas naald wordt gekalibreerd is de draad naald bekende buigen constante gedeeld door de helling van deze regressielijn.
4. Het kalibreren van de bewerking van glas naald gebruikt om de neuronen te manipuleren
- Glas naalden van voldoende compliance, 2-15 μdynes / um, experimenteel worden gebruikt op neuronen zijn gekalibreerd tegen de tussenliggende glazen naald in een analoge wijze als beschreven in paragraaf 3. Dat wil zeggen, de kandidaat-werkende naalden afleiden een tussentijdse naald van bekende stijfheid geplaatst in de positie van de draad naald in hoofdstuk 3. Glas naalden van minder dan 2 μdynes / um kunnen iets ingekort worden om ze in de juiste stijfheid bereik.
5. Naalden zijn voorbehandeld met bevestiging factoren
- Naalden te behandelen zijn gedrukt in de zijkant van een klomp klei die in een klem hierboven een 10 ml bekerglas van gehechtheid factor oplossing, zodanig dat slechts het topje van de naald is ondergedompeld in de oplossing. Onderdompelen van de capillair as is ongewenst omdat het verhoogt de accumulatie van coating op de punt na verloop van tijd, wat de stijfheid verandert en vermindert de naald van de werkzaamheid van gehechtheid. Een gekalibreerde naald kan alleen worden gebruikt ongeveer 4 keer en kan opnieuw worden gekalibreerd voor de nauwkeurigheid. De naalden worden opeenvolgend gedompeld in 0,1% polylysine-oplossing gedurende 30 minuten en daarna Concanavaline A (1 mg / ml in PBS) gedurende 30 minuten. De polylysine kan herhaaldelijk gebruikt worden voor enkele weken en wordt opgeslagen bij -20 ° C. Maak ConA verse wekelijks en bewaar bij 4 ° C. Voor andere celtypes de moleculen gepresenteerd aan hun oppervlak door de naald kan rechtstreeks het verloop van het onderzoek.
6. Apparatuur instellen
- Het trekkende werkplek is ingesteld op een trillingsisolerende tafel. Het bestaat uit een omgekeerde microscoop uitgerust met een bar langs de linker boven het podium en een hydraulische manipulator die eraan verbonden zijn, houden onze gecompenseerd custom uitbreiding, waarin de dubbele gereedschapshouder is geplaatst. De positie van de hydraulische micromanipulator langs de bar, door er een naald in de houder in het licht van de microscoop het pad, terwijl de manipulator van de controles zijn gecentreerd in hun assortiment. Op het moment dat de naald wordt behandeld met attachment factoren, zet de Ringcubator of andere microscoop verwarmen systeem, dus het podium is bij thermische evenwicht in het begin van de experimenten.
7. Het uitlijnen van de naalden
- Het doel is om de twee naalden (de referentie-en het werken naald) te krijgen in de visuele de microscoop veld zo gerangschikthun tips zijn ongeveer 50 micrometer uit elkaar, uit elkaar, met de referentie boven de cultuur schotel, dus een beetje uit focus bij het trekkende naald in focus is op de schotel. De twee naalden in hun naald houders zijn gemonteerd in een Leica double-tool de houder, die zelf een klein micromanipulator. Met behulp van de micromanipulatie van de dubbele-tool de houder, worden de twee uiteinden gebracht parallelle uitlijning. Steek de naald in een referentie naaldhouder slechts een korte afstand, genoeg om de aanscherping kraag te grijpen en deze vergadering plaats in de rechterkant van de dubbele gereedschaphouder. Steek de behandelde werken naald de helft van zijn lengte in de naaldhouder en plaats deze in de linkerkant van de dubbele gereedschaphouder. Wanneer de twee naald tips zijn gebracht op dezelfde positie naar voren en een rij, de verschillende lengtes van de naalden in hun houders wankelt de kragen, zodat ze geen belemmering vormen voor het krijgen van de tips heel dicht bij elkaar. Paragrafen 7.2 tot 7.4 worden gedaan zonder vergroting. Secties 7.5-7.8 worden uitgevoerd onder microscopische observatie.
- Pre-set de hydraulische micromanipulator zodat de verticale controle is helemaal naar boven. Stel de andere besturingselementen naar het centrum van hun assortiment, en ook de vooruit / achteruit schroef van de gereedschaphouder.
- Breng de twee naalden tips met behulp van de side-to-side stelschroef aan de rechterkant van het gereedschap houder. Duw de naald houders zelf vooruit of achteruit in de dubbele gereedschapshouder als nodig is om de naald te brengen tips om hetzelfde voorste positie. Onderzoek het paar vanaf de zijkant en gebruik de goede kant naar boven / beneden schroeven om de tips te brengen in hetzelfde vlak. Draai de naald houders in de houder om de kloof als een naald hoeken in de naaldhouder te sluiten.
- Swing het gereedschap houder en plaats de uiteinden in het licht pad boven het oppervlak van de media, hengelen ze naar beneden steil. Draai het kogelgewricht schroef aan de basis voordat u uw hand weg.
- Vind uw naald tips in visuele van de microscoop veld voordat u ze te ver naar beneden en breken ze of fout ze met puin op de bodem van de cultuur schotel. In een 60 mm schotel, 15 ml medium biedt voldoende diepte voor een veiligheidsmarge boven de schotel bodem. Doe een eerste praktijk met een niet-gekalibreerde naald om het gevoel van deze stap te krijgen. Begin door te focussen omhoog boven de cellen op de bodem van de schaal met a10x doelstelling. Doe dit in een gebied van de schotel uit de buurt van lichtgevoelige of voorbeeldige experimentele cellen. Laat de naalden in de media. Verplaats de naalden van links naar rechts op zoek naar hun schaduw. Als je ziet ze niet, laat ze een beetje en verder te gaan ze in de schotel, herhaal dan de van links naar rechts passeren. Zoek de tip, door het bewegen terug (of vooruit) en naar beneden.
- Draai de side-to-side schroef om te zien welke naald u hebt gevonden. Als het beweegt met de schroef je kijkt naar de referentie-naald, als het niet het is de gekalibreerde naald. Voor de gekalibreerde naald, gebruikt u de links naar rechts schroef aan de referentie-naald duw in de richting van het. Naar voren te verplaatsen en weer op zoek naar de schaduw van de referentie's. Als het de referentie naald die je hebt gevonden, schroef naar links, terwijl het verplaatsen van de hydraulische aan de rechterkant op zoek naar de gekalibreerde naald.
- Wanneer beide naalden bevinden gebruik maken van de fijne controle van de dubbele gereedschapshouder om ze line-up. De steile hoek van de naalden komen over de rand van de schotel zorgt ervoor dat de up / down controle om ook een naar voren, verlenging component aan de opwaartse aanpassing en een verkorting met down. De linkerzijde, vooruit / terug schroef controle heeft het tegenovergestelde, het indrukken van de tip naar voren wordt ook bepaald in de schaal, trekken terug trekt de naald, terwijl het verhogen van de tip positie. Daarom zal het verhogen van de referentie en de bevordering van het gekalibreerde naald verlengen beiden om ze te maken, zelfs op de toppen terwijl ook brengen ze in de optimale verhouding van hoogte boven de schotel. Als de referentie-naald strekt zich tot ver buiten de werkende naald kunt u schroef / duwen de werkende naald beneden en naar voren, terwijl swingende de verwijzing naar beneden en inkorten tot de twee zijn en zelfs de werking naald is de onderste. Op sommige momenten de schroeven assortiment niet de naalden bij elkaar te brengen, dus je kan nodig zijn om voorzichtig schuif de houders zelf, zorg ervoor dat het kogelgewricht schroef is goed aangedraaid en gebruik je vingers geklemd tegen de rand van de gereedschapshouder te dwingen van toepassing op de slide assen. U kunt ook draaien de naald houders in de houder als voorheen, terwijl het in de media en het observeren van het effect, zien als ze dichter bij elkaar krijgt.
- Noteer het beeld van deze laatste aangepaste positie, de scheiding van de naalden, zonder enige kracht die wordt uitgeoefend is de nul-referentie-afstand. Til de naalden boven het monster vliegtuig en 'parkeren' ze aan de rand van het gezichtsveld.
- Vuil op een naald kan worden verwijderd door het verhogen van het door de meniscus. Eerste zet de verwijzing naald weg van de andere naald aan de twee uiteinden vergrendeling op elkaar te vermijden. Meerdere keren kan nodig zijn. </ Ol>
- Op dit punt, zijn de naalden direct waargenomen door de microscoop. Beginnend met celhechting, zullen opmerkingen worden gemaakt, zowel door de microscoop en op het videoscherm. De links / rechts aspect van beide is identiek, maar de boven / beneden orientatie van het beeld op het videoscherm is niet hetzelfde als (zwaartekracht) op en neer op de microscoop. Ter verduidelijking van de verschillen tussen de op / neer als direct waargenomen door de microscoop en als waargenomen op het videoscherm, zal de laatste worden aangeduid als 'up' en 'beneden', dwz tussen aanhalingstekens
- Het proces van trekken wordt gedaan door het veranderen van de positie van de twee naalden van links naar rechts ('horizontaal') op het videoscherm. Bijgevolg is de keuze van de experimentele axon in een deel van de axon de uitbreiding in dezelfde 'horizontale' richting. Het axon kunnen afwijken 'naar beneden' van 'horizontaal' met maar liefst 15 °, want dit zal worden gecompenseerd door de 'push up' manoeuvre van paragraaf 8.5. Bovendien moet het axon gekozen voor manipulatie een cellichaam de lengte of meer, met een actieve groei kegel. Axonen de uitbreiding aan de rechterkant van het cellichaam de voorkeur te wijten aan de set up van de dubbele gereedschaphouder met de werking naald gemonteerd aan de linkerkant van de referentie-naald, zoals die gold spanning tijdens het slepen de kloof tussen de twee naalden.
- Een van de belangrijkste axon die zich uitstrekt aan de linkerkant van de cel lichaam kan worden gesleept zonder heroriëntatie van de dubbel-gereedschapshouder opgezet door de verbreding van de kloof tussen de naalden en het verhogen van de referentie-naald een beetje. Dit maakt het trekkende naald meer ruimte te buigen in de richting van de referentie en daaronder door te geven indien nodig. Het trekkende zal dan door naar de links en het trekkende naald zal buigen in de richting van de referentie naald als de spanning toeneemt. Bij het analyseren van de gegevens die deze verandering in de relatie van de spanning aan de referentie-afstand is ingevoerd in de spreadsheet door het aftrekken van de naald gescheiden meting van de nul-referentie-afstand in plaats van de nul afstand van de meting.
- Verplaats de naalden dicht bij de groei kegel van het axon, opnieuw opnemen van de nul-afstand, verhoging van de naalden, en de lucht tot de vibratie isolatie tafel.
- Door eenvoudig de naald te werken voor een voortschrijdende groei kegel kan leiden tot spontane gehechtheid als de groei kegel vooruitgang. Om pro-actief te manipuleren een gehechtheid aan de groei kegel, plaats het trekkende naald naar beneden 'onder' de groei kegel en laat de naald tegen de schotel bodem. Dit zal ertoe leiden dat de naald af te buigen 'up', buigen en glijden langs de schotel in de groei van kegel, verdrijving en het verplaatsen 'naar boven'. Druk de naald tegen de schotel bodem net genoeg zodat de groei kegel haken rond de naald, maar niet zo ver dat het glijdt over de naald en dia's achteruit. Wacht 20 minuten te laten een greep te worden vastgesteld. Met ervaring, kan het slagingspercentage zo hoog als 90%, maar is meestal in de 75% bereik. In het begin van het succes percentage kan worden dichter bij de 25%. De primaire valkuil bij het begin is om 'over te manipuleren' van de groei kegel. De initiële interactie in de 'push up stap' duurt een paar seconden. De groei kegel moet dan alleen worden overgelaten aan een stevige bevestiging te vormen. Dan geduld moeten worden uitgeoefend tijdens de volgende stappen.
- Als de groei kegel is op de naald, zet een lichte spanning op door het verplaatsen van de naalden naar rechts en til de naald een beetje. Compensatie van de naald bewegen 'naar beneden' door het verplaatsen van de naald een beetje naar voren, terwijl het verhogen van. Te verhogen in stappen tot u de bijgevoegde proces dat zich uitstrekt loodrecht uit de naald en boven het oppervlak van de schotel. De loodrechte opstelling van axon zich uitstrekt van de naalden een keer trekken is begonnen is vereist voor nauwkeurige metingen van kracht, dat wil zeggen zo dat de enige toegepaste kracht vector is langs de as van het axon. Als de getrokken proces hoeken uit de buurt van de naald, is een vector van de kracht geboren langs de as van de naald in plaats van het buigen van de naald en de totale kracht is niet gemeten. Aan de weg van de plek van de eerste schotel bevestiging verbetert de vooruitzichten op een blijvende gehechtheid aan de naald. De tip kan worden boven het oppervlak van de schotel (gezien in kleine trillingen of een ander vlak van de focus van de schotel) of te raken met minimale kracht. Te veel slepen aan de oppervlakte zal schuin de metingen. Een naald vasthouden aan de schotel, of cel proces terugplaatsen op de ondergrond zal leiden tot lastdraging als je blijven proberen om het te verplaatsen, die plotseling dan 'knalt los' met mogelijk verlies van de bijlage. Om gratis de naald van een dergelijk knelpunt naar voren te verplaatsen van de naald en terug ('up' en 'down' in het vlak van het scherm) in plaats van het toevoegen van meer kracht (rechts).
- Slepen wordt bereikt door het toepassen van kleine stappen van geweld door het bewegen van de naalden uit de buurt van het cellichaam. Krachten zijn opmerved als een groeiende kloof tussen de naalden. Terwijl geleidelijk verhogen van de spanning, zorgvuldig te observeren op tekenen van onthechting van de groei conus van de naald.
- Als de groei conus los en is niet snel terugtrekken, licht dalen van de spanning en wachten, vaak de groei kegel zal 'catch up' en grijpen opnieuw naar de tip. Als het axon komt uit de naald te vangen voordat hij trekt door vangen tegen de schotel met de naald en het herhalen van de 'push up' of een 'pull-down' om een beetje spanning op zetten en ongeveer 10 min voor re-bevestiging wachten . Na twee mislukte pogingen, raden wij u aan een andere cel.
- Onderhoud de media level in de schaal door toevoeging van water per uur als tegenwicht voor de verdamping, met behulp van een markering op de zijkant van de schotel naar de oorspronkelijke diepte te geven. Met een lange Pasteur pipet, voeg langzaam water aan de zijkant van de schotel uit de buurt van de naalden. Uitbreiding van een proces dat vaak 'stalletjes' Als de media wordt hyperosmotische. Verdamping kan worden verminderd met een olie-coating op de media oppervlakte, maar dit zou moeten worden toegevoegd nadat de naald is in de media. Als de naald gaat door olie, de groei conus is veel minder kans te hechten aan de naald.
- Aan het einde van een experiment, voordat u de hoorn van de naalden uit de schotel, controleer dan de nul-afstand.
- Lees de posities van de naalden langs een horizontale as op het scherm, de positie van de cel lichaam en neem tijden. De afstand van de naalden minus de onbelaste nul afstand vermenigvuldigd met het buigen constante voor de naald is gelijk aan de μdynes van kracht wordt toegepast. Kalibreer het beeld afstanden met behulp van een podium micrometer.
- Heel belangrijk voor de kwaliteit van gegevens is het waarborgen van de referentie-afstand (nul kracht) scheiding tussen de naalden niet veranderen tijdens het experiment. Thermische veranderingen zal de apparatuur invloed op de micron schaal, doe dus niet aan de airco tijdens een experiment. Ook als uw microscoop verwarmingssysteem heeft een vertragingstijd te wachten tot je thermische stabiliteit. De Ringcubator vermindert de vertragingstijd en isoleert de thermische veranderingen in de schaal van de rest van de microscoop en de manipulatie systeem afnemende thermische drift van de nul en veranderingen in focus. Een andere kracht het veranderen van de naald gelost scheiding is de oppervlaktespanning op de naald assen. De belasting verandert met de diepte van vloeistof in de schotel. Het controleren van de referentie-afstand door een back-up van de naalden en tijdelijk het zien van de no-kracht nul afstand af en toe tijdens een experiment verbetert de kwaliteit van gegevens, zelfs als u een verandering in de afscheiding te merken.
8. Vastmaken aan cellen
9. Uitbreiding van een axon of cel proces
10. Data Analysis
11. Representatieve resultaten:
De kracht-gekalibreerde glazen naalden kunnen gemakkelijk worden toegepast op elk cellulair regio, meestal de groei kegel, zoals gevisualiseerd direct aan het licht microscopie. Met de juiste behandeling van de naald om cellulaire aansluiting te krijgen, kan mechanische spanning experimenteel worden toegepast op de cellulaire gebied van belang, of de krachten die door dat gebied kan worden gemeten. Een vertegenwoordiger neuronale slepen experiment is weergegeven in figuur 1, waar de gesleepte axon is in lengte verdubbeld in twee uur.
Figuur 1. Een gekweekte kip dorsale wortel ganglion cel met de gewenste oriëntatie voor het slepen is gekozen. De eerste nul referentie-afstand tussen de naalden is opgenomen voor de experimentele manipulatie begint (A). De 'push up' manoeuvre wordt toegepast op de groei kegel (B). Towing begint met verhoogde lastdraging zoals aangegeven door de scheiding van de naalden (C). Slepen heeft het axon uitgebreid, hebben de 'horizontale' en loodrecht uitlijningen van het getrokken axon en het werken naald vergemakkelijkt een goede kracht metingen (D). Bar = 40 micrometer. Naald kalibratie = 6,9 μdyne / um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Technieken toe te passen en te meten cellulaire krachten hebben een lange geschiedenis 9. Onze methode werd oorspronkelijk ingegeven door het werk van Dennis Bray, die vroeger glas naalden vergelijkbaar met die van ons met 'slepen' neuronen met een constante snelheid met behulp van een gemotoriseerd hydraulische inrichting 10. Er zijn veel alternatieve middelen van de toepassing van krachten om cellen die onder andere: stappenmotoren 11, 12 magnetische korrels, microfabricated balken 13 en vloeistof stroomt 14. Deze laatste zijn vergelijkbaar met onze aanpak in dat de cellulaire sonde is uiteindelijk gekalibreerd tegen een buiging straal van bekende stijfheid en de mobiele metingen zijn afhankelijk van optische microscopische waarnemingen. In vergelijking met andere benaderingen, het belangrijkste voordeel van onze methode 3 is de mogelijkheid om gelijktijdig toe te passen en krachten meten in de μdyne range gebruik maken van apparatuur (microscopen en micromanipulators) typerend voor life science-afdelingen.
Met behulp van deze methoden, de krachten uitgeoefend door neuronale groei kegels als ze vooraf zijn gemeten 15. De mechanische relatie van axonale rek tarief in reactie op de spanning is vastbesloten om een Newtoniaanse vloeistof-achtige stimulus-respons relatie 7 te volgen. De relatieve gevoeligheid van axonen in reactie op de spanning bleek groter te zijn voor centrale hersenen neuronen dan voor perifere neuronen van de kip embryo 2. Intrekken van axonen is ook onderzocht 7. Neuronen met geen bepaald axonen kunnen hun axonale / dendritische polariteit gecontroleerd door de toepassing van mechanische spanning 5. In fibroblasten die GFP-gelabelde actine of tubuline, we direct gevisualiseerd de reactie van het cytoskelet om eenvoudige bevestiging van de naald, alsmede zijn reactie op veranderingen van spanningen 8. Cel bijlagen bij elkaar of substraten zijn getest 1. De voortstuwende krachten van de beweeglijke cellen kunnen worden onderzocht en de aantrekkingskracht van de naderende filipodia zou kunnen worden gemeten 16. De bewegingen weergegeven door het label mitochondria binnen gesleept axonen zijn gebruikt om de model intern transport materiaal (lage snelheid transport) en te bepalen dat de neuronen groeien door geïntercaleerde massa toevoeging over de lengte van de axonale as 6,17.
Voor de onderzoekers alleen maar geïnteresseerd zijn in het toepassen van krachten, zonder ze te meten, is het gebruik van de referentie-naald niet nodig 18. In tegenstelling, als kracht metingen gewenst zijn de referentie-naald is essentieel om accurate gegevens te genereren. Over het algemeen schatten we de fout in de absolute kracht metingen in het bereik van 5% tot 10% met de grootste bron van fouten die zich voordoen in de gegevens leesproces. De moeilijkheid is precies in het identificeren van de locatie van de onscherpe referentie-naald en het minimaliseren van de effecten van kleine heen en weer bewegingen (trillingen) van de naalden. Zonder een referentie-naald, zouden deze bronnen van fouten worden nog groter.
Experimentele manipulaties hoeft niet te eindigen met het trekkende sessie. Getrokken groei kegels kan worden aangesloten op andere cellen of opnieuw aan het gerecht 5. Met behulp van deze manipulatieve kans, kon neuronale micro-circutry bewust worden geconfigureerd, waardoor overspraak van de verschillende celtypen te worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij dankbaar erkennen de belangrijke bijdragen van dr. Robert E. Buxbaum in de ontwikkeling van deze methodologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. The Neuron in Tissue Culture. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts. J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).
- Yoneda, M. Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1. Journal of Experimental Biology. 37, (1960).
- Bray, D. Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture. Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Fass, J. N., Odde, D. J. Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads. Biophys J. 85, 623-636 (2003).
- Yang, S., Saif, M. T. A. Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response. Exp Mech. 49, 135-151 (2009).
- Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites. Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Direct evidence that growth cones pull. Nature. 340, 159-162 (1989).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Growth cone behavior and production of traction force. J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).
- O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope. Biotechniques. 35, 708-708 (2003).
