Summary
Mesures d'application directe et des forces sur les neurones dans la gamme 2000-1000 Microdyne sont atteints avec une grande précision en utilisant des aiguilles de verre calibré. Cette méthodologie peut être utilisée pour contrôler et mesurer plusieurs aspects du développement axonal, y compris l'initiation axonale, la tension axonale, la vitesse d'élongation des axones, et les vecteurs de la force.
Abstract
Manipulations de cellules et d'extension des axones neuronaux qui peut être accompli avec le verre calibrées de micro-fibres capables de mesurer et d'appliquer des forces dans la gamme de 1,2 10-1000 μdyne. Les mesures de force sont obtenues par l'observation de la flexion Hooke des aiguilles de verre, qui sont calibrés par une méthode directe et empirique 3. Équipement requis et les procédures de fabrication, d'étalonnage, le traitement et l'utilisation des aiguilles sur les cellules sont entièrement décrits. La force de régimes types cellulaires différents utilisés précédemment et dans laquelle ces techniques ont été appliquées démontrer la flexibilité de la méthodologie et sont donnés comme exemples d'une enquête future 4-6. Les avantages techniques sont l'continu "visualisation" des forces produites par les manipulations et la capacité d'intervenir directement dans une variété d'événements cellulaires. Il s'agit notamment de la stimulation directe et la régulation de la croissance axonale et la rétraction 7, ainsi que le détachement et mesures mécaniques sur tout type de cellule cultivée 8.
Protocol
1. Fabrication d'aiguilles de verre.
- Un réglage micro-aiguille extracteur est utilisé pour fabriquer des aiguilles avec une pointe effilée d'environ 4 mm de longueur et qui sont fermés poutres solides. Par opposition à un bout de temps flexible, cette courte longueur de 4 mm limite les vibrations de l'aiguille lors d'expériences. Lors de la région proximale de la fibre de 4 mm, l'aiguille se rétrécit rapidement à partir du diamètre du tube de verre à 15 um à 1 mm, tandis que la plus distale de 1 mm de la fibre est de 2,5 m de diamètre. Nous utilisons R-6 tube capillaire en verre, OD 0,9 mm, 0,6 mm ID 8 "longueur et un extracteur de BB-CH. Si l'enquêteur est intéressé par les gammes de mesure autre force, des aiguilles avec des propriétés différentes de printemps (c'est à dire d'une longueur différente et ou ) d'épaisseur doit être retiré. Chaque tube capillaire tire en quatre 2 "aiguilles. Les aiguilles sont stockées dans couverte de 160 mm avec des boîtes de Petri "serpents" deux pâte à modeler dans lequel les aiguilles sont légèrement foulées.
- Les aiguilles de verre, ainsi que d'une aiguille de fil à décrire, sont essentiellement utilisées comme poutres ressorts de flexion de rigidité appropriée pour les mesures souhaitées de la force. Notez que la force de flexion d'une poutre échelles comme le cube de sa longueur, indépendamment de la composition. Ainsi, pour l'une des étapes d'étalonnage décrite ci-dessous, un faisceau d'aiguilles / de rigidité insuffisante peut être faite plus rigide par une petite quantité de raccourcissement (par exemple, un raccourcissement de 10% produit une augmentation de 28% en rigidité, soit 0,9 3).
2. Faire et le calibrage d'une aiguille de fil
- Faire une aiguille de calibration de fil en insérant un 0.001 "fils chromel travers l'intérieur d'une aiguille de verre (fait à la section 1.1) avec sa pointe cassée. Tirez le fil hors de la pointe à une longueur de 26 mm et le coller en place avec super glue. Pliez les 1 mm distale du fil dans un crochet.
- Faire micro-poids de 1 mètre de 0.003 "fil de constantan. Afin de mesurer le fil, il bande à un mètre pour l'aider à faire c'est plus droit possible. Pesez les 1 m de fil de fer, précise le couper à 1 cm, et plier plusieurs morceaux dans la Vs.
- Calibrage des aiguilles de fil nécessite un microscope à dissection avec un réticule de mesure et d'un micromanipulateur. Le microscope est incliné de 90 ° sur le côté en utilisant une perche universelles, telles que la déviation vers le bas de l'aiguille de fil peuvent être observés. Montez l'aiguille de fil de l'article 2.1 dans un porte-outil sur un micromanipulateur de telle sorte que la région est accroché perpendiculairement à l'axe optique du microscope. Alignez le crochet de l'aiguille de fil avec un point du réticule. Accrochez le 1 cm de micro-poids au crochet et d'enregistrer la déviation. La constante de cintrage (μdynes / um) du fil de référence est calculé comme le rapport entre le poids des micro-(note: 1 mg = 0,98 dynes) divisée par la déviation observée (um). Pour préparer l'aiguille de fil pour la prochaine étape, couper le crochet au point de peser avec un scalpel. La présence de l'hameçon est un poids supplémentaire qui plie le fil à un petit degré. Ainsi, il les effets de la position initiale du fil dans le réticule avant que le poids est ajouté. La mesure de la constante de ressort en fil est dérivé de déviation du fil quand le poids est ajouté au point courbure (pointe avenir du fils). Lorsque l'hameçon est coupé il ne change pas la constante du ressort du fil.
3. Calibrage des aiguilles de verre intermédiaire
- Calibrage des aiguilles de verre intermédiaire nécessite l'utilisation d'un microscope inversé avec un réticule oculaire. D'un côté de la platine du microscope est un micromanipulateur mécanique utilisé pour tenir l'aiguille de fil de l'article 2 dans le centre du champ optique. De l'autre côté est un micromanipulateur trois axes hydrauliques (voir le tableau équipements) utilisé pour déplacer l'aiguille de verre intermédiaire étant calibré. Utilisation de la micromanipulateurs, amener les deux aiguilles ensemble dans le centre du champ optique à un angle de 45 ° ~ dans un 160 mm x 30 mm boîte de Petri de l'eau dans un champ de 10x.
- Une série d'aiguilles tiré avec des réglages différents sur la pipette extracteur sont d'abord produites pour l'évaluation. L'objectif est de faire une aiguille de verre intermédiaire d'un ressort de flexion constante de 20-30 μdynes / um. Détermination de la rigidité se fait en mesurant le ratio de la déviation de l'aiguille intermédiaires par rapport à la déviation de l'aiguille du fil. Par exemple, avec les aiguilles de fil et de verre toucher, l'aiguille de verre est déplacé pour faire dévier l'aiguille de fil à une distance de 5 points sur le réticule comme on le voit à travers les oculaires. Déplacement de l'aiguille de verre se désengage sur le côté des aiguilles. L'aiguille de fil puis retourne à sa position de départ, mais l'aiguille de verre sera maintenant dans une nouvelle position. La charge sur l'aiguille de verre est ensuite calculé à partir de sa nouvelle position de force de zéro moins la position des deux aiguilles à charge une force égale (deux aiguilles engagés). Dans cet exemple, si les deux aiguilles sont déviés pour marquer 5 (à partir de zéro sur le réticule), l'aiguille de fil sera de retour à zéro alors que la GLAss aiguille pourrait printemps à 25, si c'est le cas, il plié 20 points avec la même force que le fil d'aiguille fléchie 5 points. Par conséquent, le ratio de flexion entre les deux aiguilles donne l'étalonnage de l'aiguille de verre et il est raide comme ¼ de l'aiguille du fil. Parce que les calculs constante du ressort dans la section 3.4 l'utilisation des ratios de distances qu'ils sont indépendants de grossissement ou la taille de division réticule. La seule considération limitant est que les déviations sont suffisamment petits pour être dans la gamme élastique linéaire des aiguilles.
- Faites une série de déviations sur les positions des marques 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 sur le réticule. Si aucun communiqué de déflexions prématurément les répéter. Entre déflexions garder l'aiguille de fil aligné à zéro. Pour chacune de ces déviations, noter le montant détourné et la finale charge nulle position de l'aiguille de verre après leur libération. Cela crée 10 paires de points de données. D'autres séquences peuvent être utilisés, mais cette série a été conçue pour donner les premières indications de la cohérence interne, la linéarité et l'hystérésis (résultats de déviations 5 + 10 = 15, 3 +7 = 10; l'5,10,15 déflexions après la libération devrait être d'environ les mêmes au début et de fin).
- La régression linéaire des déformations enregistrées par la section 3.3 donne une quantification plus précise de la constante de courbure de l'aiguille de verre intermédiaire d'un ratio de flexion simple. Il fournit également une évaluation de la linéarité de l'aiguille et la qualité de la calibration indiqué par une valeur plus élevée r et la proximité de l'intersection de la droite de régression à zéro. Pour préparer les 10 paires de données de la section 3.3 de la régression, le deuxième nombre de paires enregistrées, la finale charge nulle position de l'aiguille de verre après leur libération, doit avoir la déviation initiale correspondante soustrait, ce qui est le premier numéro de la paire. Une fois cette opération réalisée l'ensemble des couples nouveau numéro composé de la déformation initiale et la différence calculée correspondante. Ajouter 5 paires de contrôle de 0,0 à ces 10 paires de données expérimentales pour ancrer la régression linéaire à zéro pour zéro vigueur de déviation. Ce n'est pas absolument nécessaire, mais elle ajoute un degré supplémentaire de précision. Ancrage à 0,0 est basé sur le principe que l'aiguille n'est pas pliée quand la force n'est pas appliquée. Avec ces 15 paires de données de calculer une régression linéaire. Le ressort de cintrage constante de l'aiguille de verre étalonné est l'aiguille de fil de constante connue flexion divisé par la pente de cette droite de régression.
4. Calibrage de l'aiguille de travail du verre utilisé pour manipuler les neurones
- Aiguilles de verre de la conformité suffisante, 2-15 μdynes / um, à être utilisée à titre expérimental sur les neurones sont étalonnés par rapport à l'aiguille de verre intermédiaire d'une manière analogue à celle décrite dans la section 3. C'est, d'aiguilles candidat travaille dévier une aiguille intermédiaire de la raideur connue placé dans la position de l'aiguille de fil dans la section 3. Aiguilles de verre de moins de 2 μdynes / um peuvent être légèrement raccourcis pour les amener dans la gamme de rigidité appropriée.
5. Les aiguilles sont prétraités avec facteurs d'attachement
- Aiguilles à traiter sont pressés dans le côté d'un morceau d'argile tenu dans une pince mis au dessus d'un bécher de 10 ml de solution de facteur d'attachement, de telle sorte que seule la pointe de l'aiguille est immergé dans la solution. Immergeant l'arbre tube capillaire n'est pas souhaitable car elle augmente l'accumulation de revêtement sur la pointe au fil du temps, qui change la rigidité et diminue l'efficacité de l'aiguille de l'attachement. Une aiguille calibrée ne peut être utilisé environ 4 fois et peut être recalibrée pour la précision. Les aiguilles sont trempées dans une solution de polylysine séquentielle de 0,1% pendant 30 minutes puis la concanavaline A (1 mg / ml dans PBS) pendant 30 minutes. La polylysine peuvent être utilisés de façon répétée pendant plusieurs semaines et il est stocké à -20 ° C. Faire conA hebdomadaires frais et conserver à 4 ° C. Pour d'autres types cellulaires des molécules à leur surface présentée par l'aiguille peut diriger le cours de l'enquête.
6. Matériel mis en place
- Le poste de travail de remorquage est fixé sur une table anti-vibrations. Il se compose d'un microscope inversé équipé d'une barre le long de la gauche au-dessus de la scène et un manipulateur hydraulique attaché à elle, tenant notre extension contrebalancée personnalisé, dans lequel le porte-outil double est insérée. Placez le micromanipulateur hydrauliques le long du bar, en mettant une aiguille dans son support dans le chemin de la lumière du microscope, tandis que les contrôles du manipulateur sont centrés dans leurs gammes. Au moment où l'aiguille est traitée avec des facteurs d'attachement, tournez sur la Ringcubator ou un autre système de chauffage de microscope stade, de sorte que le stade est à l'équilibre thermique au début des expériences.
7. Aligner les aiguilles
- L'objectif est d'amener les deux aiguilles (la référence et l'aiguille de travail) dans le champ visuel du microscope disposées de manièreleurs conseils sont d'environ 50 um d'intervalle, à part, avec la référence ci-dessus la boîte de culture, donc un peu floue lorsque l'aiguille est dans le remorquage se concentrer sur le plat. Les deux aiguilles dans leur porte-aiguilles sont montées dans un Leica double-porte-outil, qui est en soi une petite micromanipulateur. Utilisation de la micromanipulation du titulaire double-outil, les deux conseils sont mis en alignement parallèle. Insérez l'aiguille de référence dans un porte-aiguille à une courte distance, assez pour permettre au collier de serrage de l'adhérence et le lieu de cette assemblée dans le côté droit du porte-outil double. Insérez le traité d'aiguille travaille moitié de sa longueur dans le porte-aiguille et le placer dans le côté gauche de la porte-outil double. Lorsque les deux pointes d'aiguille sont portées à la même position en avant et la queue, les différentes longueurs des aiguilles dans leurs détenteurs échelonner les colliers de sorte qu'ils ne gênent pas trouvé les trucs très rapprochés. Les sections 7.2 à 7.4 sont effectués sans grossissement. Les sections 7.5 à 7.8 sont faites sous l'observation microscopique.
- Pré-régler le micromanipulateur hydraulique de sorte que le contrôle vertical est tout le chemin jusqu'à. Réglez les commandes d'autres au centre de leur gamme, et aussi l'avant / arrière à vis du porte-outil.
- Apportez les deux pointes d'aiguilles ensemble en utilisant la vis de réglage d'un côté à côte sur le côté droit du porte-outil. Puis poussez le porte-aiguilles se sont avant ou en arrière dans le porte-outil à double que nécessaire pour amener les pointes d'aiguille à la même position vers l'avant. Examiner la paire de côté et utiliser le côté droit haut / bas à vis d'apporter les conseils dans le même plan. Rotation porte-aiguilles dans le porte-outil pour combler le fossé si une aiguille dans les angles de ses porte-aiguille.
- Fermez le porte-outil et placez le dans le chemin de conseils lumière au-dessus de la surface du média, les pêche à pic. Serrer la vis rotule à la base avant de déplacer votre main.
- Trouvez vos bouts de l'aiguille dans le champ visuel du microscope avant de les mettre trop bas et les casser ou les mauvais avec des débris sur le fond de la boîte de culture. Dans un plat à 60 mm, 15 ml de milieu offre une profondeur suffisante pour une marge de sécurité au dessus du fond plat. Ne une pratique initiale avec une aiguille non calibré pour obtenir la sensation de cette étape. Commencez par concentrer vers le haut au-dessus des cellules sur le fond du plat avec l'objectif a10x. Pour ce faire, dans une zone de l'antenne loin de la lumière sensibles ou exemplaires cellules expérimentales. Basse aiguilles dans les médias. Déplacer le côté des aiguilles à côté la recherche de leur ombre. Si vous ne les voyez pas, un peu plus faible et les faire avancer dans le plat, répétez le côté pour passer côté. Trouver la pointe, en reculant (ou avant) et vers le bas.
- Tournez la vis de côté à côté pour voir ce qui vous avez trouvé l'aiguille. Si elle se déplace avec la vis que vous recherchez à l'aiguille de référence, si ce n'est pas ce que l'aiguille calibrée. Pour l'aiguille calibrée, utilisez le côté à vis de côté à pousser l'aiguille de référence vers elle. Déplacez-avant et en arrière à la recherche d'ombre de la référence. Si elle est l'aiguille de référence que vous avez trouvé, il vis vers la gauche tout en déplaçant la hydrauliques pour le droit à la recherche pour l'aiguille calibrée.
- Lorsque les deux aiguilles sont situés utiliser les commandes fines du porte-outil double pour les aligner. L'angle abrupt des aiguilles à venir sur le bord du plat provoque la montée / descente de contrôle d'avoir aussi un avant, un allongement de la composante ajustement à la hausse et un raccourcissement de duvet. Le côté gauche, avant / arrière de contrôle vis a l'inverse, en poussant la pointe avant est également en baisse dans le plat, le tirant en arrière retire l'aiguille tout en soulevant la position de la pointe du. Par conséquent, ce qui soulève la référence et faire avancer l'aiguille calibrée va allonger la fois pour les rendre encore à la pointe, tout en les mettant en relation optimale des hauteurs au-dessus du plat. Si l'aiguille de référence s'étend bien au-delà de l'aiguille de travail, vous pouvez visser / pousser l'aiguille vers le bas et travailler avant tout en balançant la référence vers le bas et le shortening jusqu'à ce que les deux sont même et l'aiguille de travail est le plus faible. À certains moments de la gamme vis n'apportera pas les aiguilles ensemble, de sorte que vous devrez peut-être glisser doucement les porteurs eux-mêmes, assurez-vous que la vis rotule est bien serrée et utiliser vos doigts coincés contre le bord du porte-outil pour appliquer la force pour faire glisser le arbres. Vous pouvez également faire pivoter les détenteurs aiguille dans le porte-outil comme avant, tandis que dans les médias et en observant l'effet, de voir si elles sont se rapprochent.
- Enregistrez l'image de cette position finale ajustée, la séparation des aiguilles sans aucune force appliquée est la distance de référence de zéro. Levez les aiguilles au-dessus du plan de l'échantillon et de «parc» entre eux au bord du champ visuel.
- Débris sur une aiguille peut être retiré en le soulevant par le ménisque. D'abord déplacer l'aiguille de référence loin de l'autre aiguille pour éviter les deux pointes de verrouillage sur l'autre. Plusieurs passes peuvent être nécessaires. </ Ol>
- Pour ce point, les aiguilles ont été observés directement par le microscope. En commençant par la fixation des cellules, des observations seront faites à la fois à travers le microscope et sur l'écran vidéo. L'aspect le gauche / droite des deux est identique, mais l'orientation haut / bas de l'image sur l'écran vidéo n'est pas la même chose que (gravitationnelle) de haut en bas sur le microscope. Afin de clarifier les différences entre les directions haut / bas comme observé directement par le microscope et comme observé sur l'écran vidéo, ce dernier sera appelé le «haut» et «vers le bas," à savoir dans les citations
- Le processus de remorquage est effectué en modifiant la position des deux aiguilles de gauche à droite («horizontale») sur l'écran vidéo. Par conséquent, le choix de l'axone expérimentale est faite en partie sur l'axone s'étend dans le même «horizontale» de direction. L'axone peut s'écarter «descendante» du «horizontale» par autant que 15 °, comme cela sera compensé par la manœuvre du «push up» de l'article 8.5. En outre, l'axone choisi pour la manipulation doit être la longueur d'un corps cellulaire ou plus, avec un cône de croissance active. Les axones s'étendant à la droite du corps de la cellule sont préférés en raison de la mise en place du porte-outil double avec l'aiguille de travail montés à gauche de l'aiguille de référence, tels que la tension appliquée au cours de remorquage élargit l'écart entre les deux aiguilles.
- Un axone premier qui s'étend à la gauche du corps cellulaire peut être remorqué sans réorienter le titulaire double-outil mis en place en élargissant le fossé entre les aiguilles et d'élever l'aiguille de référence un peu. Cela permet à l'aiguille de l'espace de remorquage plus à fléchir vers la référence et passer sous le si nécessaire. Le remorquage sera alors l'avance pour la gauche et l'aiguille de remorquage se plie vers l'aiguille de référence augmente la tension. En analysant les données de ce changement dans la relation de tension à la distance de référence est entré dans le tableur en soustrayant la mesure de séparation aiguille de la distance de référence de zéro au lieu de la distance à zéro de la mesure.
- Déplacer les aiguilles à proximité du cône de croissance de l'axone, d'enregistrer la distance zéro, soulèvent les aiguilles, et l'air jusqu'à la table d'isolation des vibrations.
- Il suffit de mettre l'aiguille de travail devant un cône de croissance progresser peut produire l'attachement spontané que les avances du cône de croissance. Pour pro-active de manipuler une pièce jointe au cône de croissance, placer l'aiguille de remorquage vers le bas »ci-dessous« le cône de croissance et abaisser l'aiguille contre le fond plat. Cela entraînera l'aiguille pour faire dévier le «haut», de flexion et de glisser le long du plat dans le cône de croissance, délogeant et en le déplaçant "vers le haut». Appuyer l'aiguille contre le fond plat juste assez pour que le cône de croissance des crochets autour de la pointe de l'aiguille, mais pas si loin que cela glisse sur l'aiguille et glisse vers l'arrière. Attendre 20 minutes pour laisser une poignée de s'établir. Avec l'expérience, le taux de réussite peut être aussi élevé que 90%, mais est plus généralement dans la fourchette de 75%. Au début, le taux de réussite peut être plus proche de 25%. L'écueil principal lorsque l'on commence est de «plus manipuler» le cône de croissance. L'interaction initiale dans le «push step up" prend quelques secondes. Le cône de croissance devrait ensuite être laissé seul pour former un attachement ferme. Puis la patience doit être exercé au cours des étapes suivantes.
- Lorsque le cône de croissance est à l'aiguille, mettre une légère tension sur elle en déplaçant les aiguilles à droite, et d'élever l'aiguille un peu. Compenser l'aiguille se déplaçant »vers le bas» en déplaçant l'aiguille avancer un peu tout en augmentant. Levez par étapes jusqu'à ce que vous avez fixé le processus s'étendant perpendiculairement à l'aiguille et au-dessus de la surface du plat. L'arrangement perpendiculaire de l'axone qui s'étend de l'aiguille une fois de remorquage a commencé est requis pour les mesures de force précises, c'est à dire de telle sorte que le vecteur seule force appliquée est le long de l'axe de l'axone. Si les angles processus remorqué loin de l'aiguille, un vecteur de la force est née dans l'axe de l'aiguille plutôt que plier l'aiguille et la force totale n'est pas mesurée. S'éloigner de l'endroit de la pièce jointe plat initial améliore les perspectives d'un attachement durable à l'aiguille. La pointe peut être au-dessus de la surface du plat (vu dans les vibrations peu ou un autre plan de focalisation de l'antenne) ou le toucher avec la force minimale. Trop de glisser à la surface peut fausser les mesures. Une aiguille coller à la vaisselle, ou d'un processus cellulaire rattacher au substrat conduira à la force de chargement si vous essayez de le déplacer, ce qui soudain «pops lâche» avec la perte possible de l'attachement. Pour libérer l'aiguille d'un tel point de friction, de déplacer l'aiguille vers l'avant et en arrière («up» et «bas» dans le plan de l'écran) au lieu d'ajouter plus de force (à droite).
- Remorquage est réalisé en appliquant de petits incréments de la force par le déplacement des aiguilles du corps cellulaire. Les forces sont obved comme un écart croissant entre les aiguilles. Tout en augmentant progressivement la tension, d'observer attentivement pour tout signe de détachement du cône de croissance de l'aiguille.
- Si le cône de croissance se détache et se rétractant pas rapidement, diminuer la tension et attendez un peu, souvent le cône de croissance se «rattraper» et de s'accrocher à la pointe de nouveau. Si l'axone se détache de l'aiguille de l'attraper avant qu'il ne se rétracte en le piégeage contre le plat avec l'aiguille et en répétant le "push up" ou un "pull down" pour mettre un peu de tension sur elle et d'attendre environ 10 minutes pour re-attachement . Après deux tentatives infructueuses, nous vous recommandons d'utiliser une cellule différente.
- Maintenir le niveau des médias dans le plat en ajoutant de l'eau toutes les heures à l'évaporation de contrebalancer, en utilisant une marque sur le côté du plat pour indiquer la profondeur initiale. Avec une longue pipette Pasteur, ajouter lentement l'eau sur le côté de l'antenne loin des aiguilles. Extension d'un processus souvent «échoppes» si les médias devient hyperosmotique. Évaporation pourrait être atténuée par une couche d'huile à la surface des médias, mais cela devrait être ajouté après que l'aiguille est dans les médias. Si l'aiguille traverse le pétrole, le cône de croissance est beaucoup moins susceptible d'attacher à l'aiguille.
- A la fin d'une expérience, avant de vous soulever les aiguilles hors de la vaisselle, vérifiez la distance zéro.
- Lire les positions des aiguilles le long d'un axe horizontal sur l'écran, la position du corps cellulaire et un temps record. La distance de séparation des aiguilles moins la distance déchargé de zéro multiplié par la constante de pliage pour que l'aiguille est égale à la μdynes de force étant appliquée. Calibrer les distances image à l'écran en utilisant un micromètre.
- Très important pour les données de qualité est d'assurer la distance de référence (zéro vigueur) la séparation entre les aiguilles ne change pas pendant l'expérience. Les changements thermiques vont affecter l'équipement à l'échelle du micron, c'est à dire ne pas allumer la climatisation pendant une expérience. Aussi, si votre système de chauffage microscope a un temps de latence d'attendre jusqu'à ce que vous avez stabilité thermique. Le Ringcubator diminue le temps de latence et isole aussi les changements thermiques dans le plat du reste du microscope et système de manipulation de diminuer la dérive thermique du zéro et de changements d'orientation. Une autre force de modifier la séparation déchargé de l'aiguille est la tension de surface sur les arbres à aiguilles. Les changements de charge avec la profondeur de liquide dans le plat. Vérification de la distance de référence en sauvegardant les aiguilles et temporairement de voir la distance sans force nulle occasionnellement lors d'une expérience améliore la qualité des données, même si vous êtes de noter un changement dans la séparation.
8. Fixation des cellules
9. Extension d'un processus d'axone ou de la cellule
10. Analyse des données
11. Les résultats représentatifs:
La force calibré aiguilles de verre peut facilement être appliquée à toute la région cellulaire, généralement le cône de croissance, comme visualisés directement par microscopie optique. Avec un traitement approprié de l'aiguille pour obtenir l'attachement cellulaire, la tension mécanique peut être appliqué expérimentalement à la région cellulaires d'intérêt, ou les forces produites par cette région peut être mesurée. Une expérience représentative neuronale remorquage est montré dans la figure 1, où l'axone remorqué a été doublé en longueur en deux heures.
Figure 1. Une dorsale de poulet en culture de cellules ganglion de la racine avec l'orientation préférée pour le remorquage est choisi. La distance de référence initial de zéro entre les aiguilles est enregistrée avant la manipulation expérimentale commence (A). Le «push up» est appliqué à manoeuvrer le cône de croissance (B). Remorquage commence par charger une force accrue, comme indiqué par la séparation des aiguilles (C). Remorquage a étendu l'axone, les alignements «horizontale» et perpendiculaire de l'axone remorqué et l'aiguille de travail ont facilité les mesures de force bien (D). Barre = 40 um. Calibration aiguille = 6,9 μdyne / um.
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Discussion
Techniques d'appliquer et de mesurer les forces cellulaires ont une longue histoire 9. Notre méthode a été initialement motivé par le travail de Dennis Bray, qui ont utilisé des aiguilles de verre semblable à la nôtre de «tracter» les neurones à un taux constant en utilisant un dispositif motorisé hydraulique 10. Il ya de nombreux moyens alternatifs d'application de forces pour les cellules qui comprennent: moteurs pas à pas 11, 12 billes magnétiques, les poutres 13 et microfabriqué flux de fluide 14. Ces derniers sont similaires à notre approche en ce que la sonde est finalement cellulaires étalonnés par rapport à une poutre de flexion de la raideur connus et les mesures optiques cellulaires dépendent des observations microscopiques. En comparaison à d'autres approches, le principal avantage de notre méthode 3 est la possibilité d'appliquer simultanément et mesurer les forces de l'ordre μdyne utilisant des équipements (microscopes et micromanipulateurs) typique des départements sciences de la vie.
Avec ces méthodes, les forces exercées par des cônes de croissance neuronale à mesure qu'ils avancent ont été mesurés 15. La relation mécanique du taux d'élongation axonale en réponse à la tension a été déterminé à suivre un type fluide newtonien stimulus-réponse relation 7. La sensibilité relative des axones en réponse à la tension a été montré pour être plus grande pour les neurones du cerveau central que pour les neurones périphériques de l'embryon de poulet 2. La rétraction des axones a également été étudié 7. Neurones sans axones déterminée peuvent avoir leur polarité axonale / dendritiques contrôlée par l'application de la tension mécanique 5. Dans les fibroblastes exprimant la GFP-étiquetée actine ou la tubuline, nous avons visualisé directement la réponse du cytosquelette à l'attachement simple de l'aiguille ainsi sa réponse aux changements de tension 8. Pièces jointes les unes aux autres cellules ou de substrats ont été testés 1. Les forces de propulsion des cellules mobiles pourraient être examinées et la traction de l'approche filipodia pourrait être mesuré 16. Les motions affiché par les mitochondries dans les axones remorqué étiquetés ont été utilisés pour transporter du matériel modèle interne (transport à basse vitesse) et de déterminer que la croissance des neurones par l'ajout de masse intercalés le long de la longueur de l'arbre axonal 6,17.
Pour les enquêteurs tout simplement intéressés par l'application de forces sans les mesurer, l'utilisation de l'aiguille de référence n'est pas nécessaire 18. En revanche, si les mesures de force sont souhaitées de l'aiguille de référence est essentiel pour générer des données précises. Globalement, nous estimons l'erreur dans les mesures de force absolue d'être dans la fourchette de 5% à 10% avec la plus grande source d'erreur survenant dans le processus de lecture des données. La difficulté réside dans l'identification précise de l'emplacement de l'aiguille de référence défocalisé et en minimisant les effets de l'arrière petit-et-vient des mouvements (vibrations) des aiguilles. Sans une aiguille de référence, ces sources d'erreur serait encore plus grand.
Les manipulations expérimentales ne doivent pas fin avec la session de remorquage. Cônes de croissance remorqué peut être attaché à d'autres cellules ou rattaché à l'antenne 5. En utilisant cette possibilité de manipulation, de micro-neuronales circutry pourraient intentionnellement être configuré, permettant la diaphonie de différents types cellulaires d'être examinés.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à souligner la contribution importante de M. Robert E. Buxbaum dans le développement de cette méthodologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
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