Summary
Anwendungs-und direkte Messungen von Kräften auf Neuronen im 2-1000 Microdyne Bereich sind mit hoher Genauigkeit kalibriert Glasnadeln erreicht. Diese Methode kann verwendet werden zur Steuerung und Messung verschiedene Aspekte der axonalen Entwicklung, einschließlich der axonalen Initiierung, axonale Spannung, Geschwindigkeit der axonalen Dehnung und Kraftvektoren werden.
Abstract
Handy-Manipulationen und die Erweiterung der neuronalen Axone können mit kalibrierten Glas Mikro-Fasern für die Messung und Anwendung von Kräften in 10-1000 μdyne Bereich 1,2 erreicht werden. Kraftmessung durch Beobachtung des Hookeschen Biegen des Glases Nadeln, die durch eine direkte und empirische Methode 3 kalibrierten erhalten. Anforderungen an die Ausrüstung und Verfahren für die Herstellung, Eichung, Behandlung und Verwendung der Nadeln auf Zellen sind vollständig beschrieben. Die Kraft Regime bisher verwendeten und verschiedene Zelltypen, zu denen diese Techniken angewendet wurden demonstrieren die Flexibilität der Methode und dienen als Beispiele für zukünftige Untersuchungen 4-6 gegeben. Die technischen Vorteile sind die kontinuierliche "Visualisierung" der Kräfte, die durch die Manipulationen produziert und die Möglichkeit, direkt in eine Vielzahl von zellulären Geschehen einzugreifen. Dazu zählen direkte Stimulation und Regulation des axonalen Wachstums-und Ausfahren 7; sowie Ablösung und mechanische Messungen auf jeder Art von kultivierten Zellen 8.
Protocol
1. Herstellung von Glas Nadeln.
- Eine einstellbare Mikro-Nadel Abzieher wird benutzt, um Nadeln mit verjüngter Spitze ca. 4 mm in der Länge und die solide Balken geschlossen herzustellen. Wie eine lange flexible Spitze Gegensatz Grenzen dieser kurzen 4 mm Länge Schwingungen der Nadelspitze während der Experimente. An der proximalen Bereich des 4 mm Faser, verjüngt sich die Nadel rasch aus dem Durchmesser der Glasröhren bis 15 um innerhalb von 1 mm, während die am weitesten distal 1 mm der Faser beträgt 2,5 m im Durchmesser. Wir verwenden R-6 Glaskapillare, OD 0,9 mm, ID 0,6 mm 8 "Länge und einem BB-CH-Abzieher. Wenn der Prüfer interessiert sich für die Messung anderer Kraft reicht, Nadeln mit verschiedenen Feder-Eigenschaften (dh von unterschiedlicher Länge und oder Dicke), gezogen werden. Jede Kapillare zieht in vier 2 "Nadeln. Nadeln sind in gedeckten 160 mm Petrischalen mit zwei Modelliermasse "Schlangen", in die die Nadeln leicht angedrückt werden gespeichert.
- Das Glas Nadeln, sowie ein Draht Nadel beschrieben werden, sind im Wesentlichen Balken als Biegefedern entsprechender Steifigkeit für die gewünschten Messungen von Gewalt verwendet. Beachten Sie, dass die Biegekraft einer Balkenwaage mit der dritten Potenz der Länge, unabhängig von Komposition. Somit ist für jedes der Kalibrierung unten beschriebenen Schritte kann eine Nadel / Breite unzureichender Steifigkeit steifer gemacht, indem eine kleine Menge der Verkürzung (z. B. eine 10% ige Kürzung produziert eine 28% ige Erhöhung der Steifigkeit, dh 0,9 3).
2. Herstellung und Kalibrierung eines Drahtes Nadel
- Machen Sie einen Draht Kalibrierung Nadel durch Einfügen eines 0,001 "Chromel Draht durch das Innere eines Glasnadel (made in Abschnitt 1.1) mit der Spitze abgebrochen. Ziehen Sie den Draht aus der Spitze zu einer Länge von 26 mm und kleben Sie ihn mit Superkleber. Biegen Sie die distalen 1 mm des Drahtes in einen Haken.
- Machen Mikro-Gewichte von 1 Meter von 0,003 "Konstantan Draht. Zur Messung der Draht-, Band es zu einem Meterstab in immer es gerade wie möglich zu unterstützen. Wiegen Sie die 1 m von Draht, genau schneiden zu 1 cm lange Stücke schneiden und biegen einige Stücke in Vs
- Kalibrieren des Drahtes Nadeln erfordert ein Binokular mit einem Mess-Absehen und einem Mikromanipulator. Das Mikroskop ist um 90 ° auf die Seite mit einer Universal-Boom stehen, so dass eine nach unten gerichtete Auslenkung des Drahtes Nadel beobachtet werden kann gekippt. Montieren Sie den Draht Nadel Abschnitt 2.1 in eine Werkzeugaufnahme auf einem Mikromanipulator, so dass die süchtig Region senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops. Richten Sie die Haken des Drahtes Nadel mit einem Fadenkreuz markieren. Hängen Sie die 1 cm Mikro-Gewicht an den Haken und Aufzeichnung der Auslenkung. Durch die beobachtete Ablenkung (um) unterteilt: Das Biegen konstant (μdynes / um) der Referenz-Draht wird als das Verhältnis der Mikro-weight (1 mg = 0,98 dyn beachten) berechnet. Zur Vorbereitung der Draht Nadel für den nächsten Schritt, schneiden Sie die Haken an der Waage Punkt mit einem Skalpell. Die Anwesenheit der Haken ist, dass zusätzliches Gewicht biegt den Draht zu einem geringen Teil. So bewirkt die anfängliche Position des Drahtes in das Fadenkreuz, bevor das Gewicht hinzugefügt wird. Die Messung der Draht Federkonstante wird aus dem Draht die Auslenkung abgeleitet, wenn das Gewicht der Knickpunkt (zukünftige Spitze des Drahtes) hinzugefügt wird. Wenn der Haken abgeschnitten wird es ändert nichts an der Federkonstante des Drahtes.
3. Kalibrieren des mittleren Glasnadeln
- Die Kalibrierung des mittleren Glasnadeln erfordert den Einsatz von einem inversen Mikroskop mit einem Okular Absehen. Auf der einen Seite des Mikroskoptisches ist eine mechanische Mikromanipulator verwendet werden, um den Draht Nadel des § 2 in der Mitte des optischen Feldes zu halten. Auf der anderen Seite ist ein Drei-Achsen-hydraulischen Mikromanipulator (siehe Geräte-Tabelle) verwendet, um die Zwischen-Glas Nadel kalibriert bewegen. Mit dem Mikromanipulatoren, bringen beide Nadeln zusammen in der Mitte des optischen Feldes bei einer ~ 45 °-Winkel in eine 160 mm x 30 mm Petrischale von Wasser in einen 10-fach Feld.
- Eine Reihe von Nadeln mit verschiedenen Einstellungen auf der Pipette Abziehers werden zunächst für die Auswertung generiert. Ziel ist es, ein Zwischenprodukt Glasnadel mit einem Biege-Federkonstante von 20-30 μdynes / um zu machen. Bestimmung der Steifigkeit wird durch die Messung des Verhältnisses der Auslenkung der mittleren Nadel, um die Auslenkung des Drahtes Nadel im Vergleich durchgeführt. Zum Beispiel mit dem Draht und Glas Nadeln berühren, wird das Glas Nadel bewegt zu lenken den Draht Nadel einen Abstand von 5 Mark auf dem Fadenkreuz als durch das Auge Stücke gesehen. Das Verschieben der Glas-Nadel seitlich löst die Nadeln. Der Draht Nadel dann wieder in seine ursprüngliche Ausgangsposition, aber das Glas Nadel wird nun in eine neue Position. Die Last auf dem Glas Nadel wird dann aus ihrem neuen Null-Kraft-Position minus die Position der beiden Nadeln an gleicher Kraft Last (beide Nadeln eingesetzt sind) berechnet. In diesem Beispiel, wenn beide Nadeln abgelenkt werden bis 5 (von Null auf dem Fadenkreuz) markieren, wird der Draht Nadel zurück auf Null, während die glass Nadel könnte auf 25 Frühling, wenn ja, bog sie 20 Mark mit der gleichen Kraft, dass der Draht Nadel 5 Mark gebeugt. Daher gibt das Verhältnis der Biegung zwischen den beiden Nadeln die Kalibrierung des Glasnadel und es ist ¼ so steif wie der Draht Nadel. Da Federkonstante Berechnungen in Abschnitt 3.4 verwenden Verhältnisse der Entfernungen sind sie unabhängig von Vergrößerung oder Absehen Division Größe. Der einzige limitierende Überlegung ist, dass die Ausschläge klein genug, um in der linear-elastischen Bereich der Nadeln werden sollen.
- Sie eine Reihe von Ausschlägen an den Positionen der 5,10,15,3,7,12,17,5,10,15 Markierungen auf dem Absehen. Falls Ausschläge Release vorzeitig wiederholen Sie diese. Zwischen Ablenkungen halten den Draht Nadel auf Null ausgerichtet. Für jede dieser Ausschläge, notieren Sie den Betrag abgelenkt und die letzte Null-Last Position des Glasnadel nach der Entlassung. Dies schafft 10 Paare von Datenpunkten. Andere Sequenzen können verwendet werden, aber diese Serie wurde entwickelt, um frühe Anzeichen von inneren Kohärenz, Linearität und Hysterese (Ergebnisse der Umlenkungen 5 + 10 = 15 zu geben; 3 +7 = 10; die 5,10,15 Ausschläge nach der Entlassung sollte etwa das gleiche am Anfang und Ende).
- Lineare Regression der aufgezeichneten Ausschläge aus Abschnitt 3.3 gibt eine genauere Quantifizierung der Biege-Konstante des mittleren Glasnadel als eine einzige Ablenkung Verhältnis. Es bietet auch eine Beurteilung der Linearität der Nadel und die Qualität der Kalibrierung durch einen höheren R-Wert und die Nähe der Achsenabschnitt der Regressionsgeraden auf Null angegeben. Zur Vorbereitung der 10 Datenpaare aus Abschnitt 3.3 für die Regression, muss die zweite Zahl der registrierten Paaren, die letzte Null-Last Position des Glasnadel nach der Entlassung sind die entsprechenden Anfangsauslenkung von ihm abgezogen, die die erste Zahl ist das Paar. Nachdem diese Operation durchgeführt wird die Menge der neuen Zahlenpaare aus der anfängliche Ausschlag und die entsprechende Differenz berechnet. Add 5 Kontroll-Paare 0,0 bis diese 10 experimentellen Datenpaare die lineare Regression bei Null Kraft für null Ablenkung zu verankern. Dies ist nicht zwingend erforderlich, aber fügt einen zusätzlichen Grad an Genauigkeit. Ankern bei 0,0 beruht auf dem Prinzip, dass die Nadel nicht geknickt, wenn Kraft nicht angewendet wird. Mit diesen 15 Datenpaare Berechnung einer linearen Regression. Das Biegen Federkonstante der Glasnadel kalibriert wird der Draht Nadel bekannt ist Biegen konstant durch die Steigung dieser Regressionsgeraden aufgeteilt.
4. Kalibrieren der Bearbeitung von Glas Nadel verwendet werden, um Neuronen zu manipulieren
- Glasnadeln ausreichender Compliance, 2-15 μdynes / pm, experimentell auf Neuronen verwendet werden gegen die Zwischenschicht Glasnadel in analoger Weise kalibriert, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Das heißt, abzulenken Kandidaten arbeiten Nadeln ein Zwischenprodukt Nadel bekannter Steifigkeit in die Position des Drahtes Nadel in Abschnitt 3 platziert. Glass Nadeln von weniger als 2 μdynes / um dürfen leicht gekürzt werden, um sie in die entsprechende Steifigkeit Bereich zu bringen.
5. Nadeln sind mit Anheftungsfaktoren vorbehandelten
- Needles behandelt werden sollen in die Seite ein Klumpen Ton in einer Klemme über einen 10-ml-Becher der Befestigung Faktor-Lösung, so dass nur die Spitze der Nadel in die Lösung eingetaucht gesetzt gedrückt gehalten. Eintauchen der Kapillarrohr Welle ist unerwünscht, weil sie die Anhäufung von Beschichtung erhöht an der Spitze im Laufe der Zeit, die die Steifigkeit Veränderungen und vermindert die Nadel die Wirksamkeit der Anlage. Eine geeichte Nadel nur etwa 4-mal verwendet werden und kann für die Richtigkeit neu kalibriert werden. Die Nadeln werden nacheinander in 0,1% Polylysin-Lösung für 30 Minuten und dann Concanavalin A (1 mg / ml in PBS) für 30 Minuten getaucht. Das Polylysin kann wiederholt für mehrere Wochen eingesetzt werden und ist bei -20 ° C gelagert Machen conA frischen wöchentlich und lagern bei 4 ° C. Für andere Zelltypen der Moleküle präsentiert auf ihrer Oberfläche durch die Nadel kann direkt den Verlauf der Untersuchung.
6. Ausstattung eingerichtet
- Das Abschleppen Arbeitsplatz ist auf einer Schwingungsisolierung Tabelle gesetzt. Es besteht aus einem inversen Mikroskop mit einer Bar auf der linken über die Bühne und einen hydraulischen Manipulator befestigt ist, hält unsere ausgeglichen benutzerdefinierte Erweiterung, in die die doppelte Werkzeughalter eingesetzt ausgestattet ist. Position der hydraulischen Mikromanipulator entlang der bar, indem eine Nadel in die Halterung in das Mikroskop ist Lichtweg, während des Manipulators Kontrollen in ihren Bereichen sind zentriert. Zum Zeitpunkt der Nadel mit Anheftungsfaktoren behandelt wird, auf dem Ringcubator oder andere Mikroskoptisch Heizung drehen, so ist die Bühne im thermischen Gleichgewicht zu Beginn der Versuche.
7. Ausrichten der Nadeln
- Ziel ist es, die beiden Nadeln (der Referenz-und Arbeitsbedingungen Nadel) in das Mikroskop Blickfeld bekommen so angeordnet,ihre Spitzen sind etwa 50 um auseinander, auseinander, mit dem Hinweis über der Kulturschale, daher etwas aus dem Fokus, wenn das Abschleppen Nadel im Fokus ist auf die Schüssel. Die beiden Nadeln in ihre Nadelhalter sind in einem Leica Doppel-Werkzeughalter, die selbst eine kleine Mikromanipulator montiert. Mit der Mikromanipulation der Doppel-Werkzeughalter sind die beiden Spitzen in parallele Ausrichtung gebracht. Legen Sie die Referenz-Nadel in einen Nadelhalter nur eine kurze Strecke, genug, um die Verschärfung Kragen zu greifen und platzieren Sie diese Baugruppe in die rechte Seite des Doppel-Werkzeughalter. Legen Sie die behandelten arbeiten Nadel die Hälfte seiner Länge in den Nadelhalter und legen Sie sie in die linke Seite des Doppel-Werkzeughalter. Als die beiden Nadelspitzen auf die gleiche vordere Position gebracht werden und aufgereiht, taumeln die unterschiedlichen Längen der Nadeln in ihren Inhabern die Krägen, so dass sie nicht behindern immer die Spitzen sehr nahe beieinander. Abschnitte 7.2 bis 7.4 sind ohne Vergrößerung gemacht. § § 7,5 bis 7,8 werden unter mikroskopischer Beobachtung gemacht.
- Der hydraulischen Mikromanipulator Pre-set so die vertikale Steuerung ist den ganzen Weg bis. Stellen Sie die anderen Steuerelemente in die Mitte ihrer Reichweite, und auch die Vor / Zurück Schraube des Werkzeughalters.
- Bringen Sie die beiden Nadeln Spitzen zusammen, indem Sie die Seite an Seite Stellschraube auf der rechten Seite des Werkzeughalters. Dann drücken Sie den Nadelhalter sich nach vorne oder hinten in der Doppel-Werkzeughalter wie notwendig, um die Nadelspitzen auf die gleiche vordere Position zu bringen. Untersuchen Sie das Paar von der Seite und die rechte Seite nach oben / unten Schraube, um die Tipps in der gleichen Ebene zu bringen. Drehen Nadelhalter in den Werkzeughalter, um die Lücke, wenn eine Nadel Winkel in seiner Nadelhalter zu schließen.
- Schwingen Sie den Werkzeughalter und legen Sie die Tipps in den Strahlengang über die Oberfläche der Medien, Angeln ihnen steil hinunter. Ziehen Sie das Kugelgelenk Schraube an der Unterseite, bevor Sie Ihre Hand weg zu bewegen.
- Finden Sie Ihre Nadelspitzen in das Mikroskop Blickfeld, bevor Sie sie bringen zu weit nach unten und brechen sie oder Foul sie mit Schutt auf dem Boden der Kulturschale. In einer 60 mm Schale, bietet 15 ml Medium eine ausreichende Tiefe für einen Sicherheitsabstand zu den Schalenboden. Sie einen ersten Praxis mit einem unkalibrierten Nadel, um das Gefühl von diesem Schritt zu bekommen. Beginnen Sie mit dem Schwerpunkt nach oben über die Zellen am Boden der Schale mit A10X Ziel. Tun Sie dies in einem Gebiet von der Schüssel weg von lichtempfindlichen oder beispielhafte experimentelle Zellen. Senken Sie die Nadeln in den Medien. Bewegen Sie den Nadeln einer Seite zur anderen auf der Suche nach ihrem Schatten. Wenn Sie nicht sehen können, senken sie ein wenig und verschieben Sie sie nach vorne in die Schüssel, wiederholen Sie die Seite zur anderen weitergeben. Finden Sie die Spitze, indem sie wieder (oder vorwärts) und nach unten.
- Drehen Sie die Seite an Seite Schraube zu sehen, welche Nadel Sie gefunden haben. Wenn es mit der Schraube, die Sie in der Referenz-Nadel suchen sich bewegt, wenn sie nicht es ist die kalibrierte Nadel. Für die kalibrierte Nadel, die seitlich Schraube, um die Referenz-Nadel in Richtung schieben. Move it vorwärts und rückwärts auf der Suche nach der Referenz der Schatten. Wenn sie den Verweis Nadel Sie gefunden haben, ist, schrauben Sie ihn nach links, während Sie den hydraulischen nach rechts auf der Suche nach der Nadel kalibriert.
- Wenn beide Nadeln liegen, müssen Sie die feine Steuerung der Doppel-Werkzeughalter, um sie line up. Die steilen Winkel der Nadeln kommen über den Rand der Schale bewirkt, dass die up / down-Steuerung, um auch eine nach vorne, Verlängerung Komponente, um die Anpassung nach oben und eine Verkürzung mit nach unten. Auf der linken Seite, vorne / hinten Schraube Kontrolle hat das Gegenteil, schob die Spitze nach vorne ist auch nach unten in die Schüssel und zieht ihn zurück zieht die Nadel beim Anheben der Spitze der Position. Daher wird Anheben der Referenz-und Vorschieben des kalibrierten Nadel verlängern beide, sie sogar an der Spitze zu machen und gleichzeitig bringt sie in das optimale Verhältnis von Höhen über der Schüssel. Wenn die Referenz-Nadel reicht weit über die Arbeiterklasse Nadel können Sie Schraube / push die Arbeiterklasse Nadel nach unten und vorne beim Schwingen der Referenz nach unten und die Verkürzung es, bis die beiden auch sind, und die Arbeiterklasse Nadel wird die untere. In Zeiten der Schrauben Bereich wird nicht zu den Nadeln zusammen, so müssen Sie eventuell schieben Sie die Halterungen selbst, stellen Sie sicher, das Kugelgelenk Schraube gut festgezogen ist und mit den Fingern gegen die Kante des Werkzeughalters verkeilt, um Gewalt anzuwenden, um die Folie Wellen. Sie können auch drehen Sie den Nadelhalter in den Werkzeughalter nach wie vor, während in den Medien und die Beobachtung der Wirkung, zu sehen, wenn sie näher zusammen sind.
- Nehmen Sie das Bild dieses letzten eingestellten Position, ist die Trennung der Nadeln ohne Kraftaufwand die Null-Referenz-Strecke. Heben Sie die Nadel über der Objektebene und "parken" sie am Rand des Gesichtsfeldes.
- Kleine Partikel auf einer Nadel kann durch Anheben durch den Meniskus entfernt werden. Zuerst bewegen Sie den Verweis Nadel weg von den anderen Nadel, die beiden Spitzen Aufrasten auf einander zu vermeiden. Mehrere Durchgänge erforderlich sein. </ Ol>
- Zu diesem Punkt haben die Nadeln wurden direkt durch das Mikroskop beobachtet. Beginnend mit Zelladhäsion, werden Beobachtungen sowohl durch das Mikroskop und auf dem Bildschirm vorgenommen werden. Die links / rechts Aspekt der beiden ist identisch, aber die up / down Ausrichtung des Bildes auf dem Bildschirm ist nicht dasselbe wie (Gravitation) oben und unten auf die Lupe genommen. Zur Klärung der Unterschiede zwischen den Tasten auf / ab, die sich unmittelbar unter dem Mikroskop beobachtet und als auf dem Bildschirm beobachtet, wird dieser als 'up' und 'down', dh in Anführungszeichen bezeichnet werden
- Der Prozess der Anhängelast ist durch Veränderung der Position der beiden Nadeln von links nach rechts ("horizontale") auf dem Bildschirm erfolgen. Daher ist die Wahl der experimentellen Axon zum Teil auf das Axon, die sich in der gleichen "horizontale" Richtung gemacht. Das Axon kann "nach unten" von "horizontalen" abweichen so viel wie 15 °, wie dies auch bei der "Push up"-Manöver Abschnitt 8.5 ausgeglichen werden. Darüber hinaus sollte das Axon zur Manipulation gewählt einer Zelle des Körpers Länge oder mehr betragen, mit einer aktiven Wachstums-Membran. Axone Ausdehnung auf der rechten Seite des Zellkörpers sind aufgrund der sich aus der doppelten Werkzeughalter mit dem Arbeitstitel Nadel montiert auf der linken Seite des Referenz-Nadel gesetzt, erweitert, so dass angelegten Spannung beim Abschleppen die Lücke zwischen den beiden Nadeln bevorzugt.
- Ein Paradebeispiel Axon, die auf der linken Seite des Zellkörpers erstreckt ohne Neuausrichtung der Doppel-Werkzeughalter durch die Kluft zwischen den Nadeln und der Erhöhung auf Nadel ein wenig gesetzt abgeschleppt werden. Dies ermöglicht dem Abschleppen Nadel mehr Platz, um auf die Referenz-flex und geben darunter, wenn nötig. Das Abschleppen wird dann auf der linken Seite voraus und das Schleppen Nadel wird auf die Referenz-Nadel als Spannung steigt biegen. Bei der Analyse der Daten diese Änderung in das Spannungsverhältnis der Referenzstrecke in der Tabelle durch Subtraktion der Nadel Trennung Messung von der Null-Referenz-Strecke statt der Null-Abstand von der eingegeben.
- Bewegen der Nadeln in der Nähe der Wachstumskegel des Axons, notieren Sie die Null-Abstand wieder erhöhen die Nadeln, und in der Luft die Schwingungsisolierung Tisch.
- Einfach indem die Arbeiterklasse Nadel vor einer fortschreitenden Wachstum Kegel kann spontane Anlage als das Wachstum Kegel Fortschritte zu produzieren. Pro-aktiv zu manipulieren einer Anlage, um das Wachstum Kegel, statt das Schleppen Nadel "unten" das Wachstum Kegel und senken Sie dann die Nadel gegen die Schale unten. Dadurch wird die Nadel abzulenken 'up', Biege-und Gleiten entlang der Schüssel in das Wachstum Kegel, verdrängen es und bewegte es "aufwärts". Drücken Sie die Nadel gegen die Schale unten einfach genug, so dass das Wachstum Kegel um die Nadelspitze Haken, aber nicht so weit, dass sie über die Nadel und schiebt sich zurück rutscht. Warten Sie 20 Minuten, damit in den Griff etabliert. Mit Erfahrung, kann die Erfolgsrate so hoch sein wie 90%, ist aber in der Regel im 75% Bereich. Zunächst werden die Erfolgsquote kann näher an 25%. Der primäre Fallstrick beim Beginn, ist "über manipulieren das Wachstum Kegel. Die initiale Interaktion in die "Push up step 'dauert nur wenige Sekunden. Das Wachstum Kegel sollten dann in Ruhe gelassen werden, um eine feste Bindung zu bilden. Dann Geduld muss während der folgenden Schritte ausgeübt werden.
- Wenn das Wachstum Kegel auf die Nadel, setzte eine leichte Spannung, die ihm durch Bewegen der Nadeln auf der rechten Seite, und heben Sie die Nadel ein wenig. Kompensieren Sie die Nadel bewegt "nach unten", indem Sie die Nadel ein wenig nach vorn beim Anheben. Raise in Stufen, bis Sie das beigefügte Prozess senkrecht von der Nadel und über der Oberfläche der Schale haben. Die senkrechte Anordnung der Axon, die sich von den Nadeln einmal Abschleppen begonnen hat, ist für eine genaue Kraftmessungen erforderlich, dh so, dass die alleinige Anwendung Kraftvektor entlang der Achse des Axons ist. Wenn die gezogene Prozess Winkel weg von der Nadel ist ein Vektor der Kraft entlang der Achse der Nadel statt Verbiegen der Nadel und die gesamte Kraft wird nicht gemessen geboren. Raus aus der Stelle des ursprünglichen Gericht Befestigung verbessert die Aussichten auf eine dauerhafte Bindung an die Nadel. Die Spitze kann über die Oberfläche der Schale (beobachtet bei kleinen Erschütterungen oder einer anderen Ebene des Fokus von der Schale) oder Berühren mit minimalem Kraftaufwand werden. Zu viel an der Oberfläche wird skew die Messungen zu ziehen. Eine Nadel Festhalten an der Schale, oder eine Zelle Prozess Wiederanbringen auf dem Substrat führt zu zwingen Laden, wenn Sie versuchen, ihn zu bewegen halten, die dann plötzlich "erscheint locker" mit den möglichen Verlust der Anlage. Um kostenlos die Nadel aus wie ein Knackpunkt, bewegen Sie die Nadel nach vorne und hinten ('up' und 'down' in der Ebene des Bildschirms) anstelle der Zugabe mehr Kraft (rechts).
- Abschleppen wird durch Anlegen kleinen Schritten von Gewalt durch Bewegen der Nadeln weg vom Zellkörper erreicht. Die Kräfte sind Beobved, da eine zunehmende Kluft zwischen den Nadeln. Während die schrittweise Erhöhung der Spannung, sorgfältig auf Anzeichen von Ablösung des Wachstums Kegel von der Nadel zu beobachten.
- Wenn das Wachstum Kegel abnehmen und ist nicht schnell Zurückziehen, verringern Sie die Spannung ein wenig und warten, oft das Wachstum Konus "catch up" und greifen auf die Spitze wieder. Wenn das Axon kommt aus der Nadel zu fangen, bevor es zieht durch Abfangen gegen die Schale mit der Nadel und wiederholen die "Push up" oder "Pull-down ', um ein wenig Spannung auf sie setzen und warten Sie etwa 10 min für re-Anlage . Nach zwei gescheiterten Versuchen, empfehlen wir die Verwendung einer anderen Zelle.
- Pflegen Sie die Medien-Ebene in die Schüssel durch Zugabe von Wasser stündlich um ein Gegengewicht Verdunstung durch eine Markierung auf der Seite der Schale auf die ursprüngliche Tiefe zeigen. Mit einer langen Pasteurpipette langsam Wasser an der Seite der Schale weg von den Nadeln. Erweiterung eines Prozesses oft "Buden", wenn die Medien wird hyperosmotischen. Evaporation konnte mit einem Öl-Beschichtung auf der Oberfläche des Mediums vermindert werden, aber dies müsste hinzugefügt werden, nachdem die Nadel in den Medien. Wenn die Nadel durch Öl, ist das Wachstum Kegel weit weniger wahrscheinlich, um die Nadel legen.
- Am Ende eines Experiments, bevor Sie heben die Nadeln aus der Schale, überprüfen Sie die Null zu erreichen.
- Lesen Sie die Positionen der Nadeln entlang einer horizontalen Achse auf dem Bildschirm, die Position der Zellkörper und Bestzeiten. Der Abstand der Nadeln minus unbelasteten Null Abstand von der Biege-Konstante für die Nadel multipliziert die μdynes von Gewalt angewendet wird. Kalibrieren Sie den Bildschirm Bildweiten mit einem Objektmikrometer.
- Sehr wichtig für die Qualität von Daten ist die Gewährleistung der Referenzstrecke (Null Kraft) Trennung zwischen den Nadeln nicht während des Experiments zu ändern. Thermische Veränderungen werden die Geräte auf der Mikrometer-Skala beeinflussen, dh nicht auf die Klimaanlage wieder während eines Experiments. Auch wenn Ihr Mikroskop Heizung hat eine Zeitverzögerung warten Sie, bis thermische Stabilität aufweisen. Die Ringcubator verringert sich die Verzögerungszeit und isoliert die thermische Veränderungen in der Schale von dem Rest des Mikroskops und Manipulation System abnehmenden thermischen Drift der Null und Veränderungen im Mittelpunkt. Eine weitere Kraft Änderung der Nadel abgeladen Trennung ist die Oberflächenspannung an der Nadel Wellen. Die Belastung ändert sich mit der Tiefe der Flüssigkeit in der Schale. Überprüfung der Referenz-Entfernung durch die Sicherung der Nadeln und vorübergehend sehen die no-force Null Abstand gelegentlich während eines Experiments verbessert die Qualität der Daten, auch wenn Sie der Feststellung einer Änderung in der Trennung.
8. Anbringen von Zellen
9. Erweitern eines Axon oder Zell-Prozess
10. Data Analysis
11. Repräsentative Ergebnisse:
Die Kraft-kalibriert Glasnadeln einfach an jede zelluläre Region angewendet werden, in der Regel das Wachstum Kegel, als direkt visualisiert mittels Lichtmikroskopie. Bei entsprechender Behandlung der Nadel auf eine Anheftung der Zellen zu erhalten, können mechanische Spannung experimentell die zelluläre region of interest angewendet werden, oder die Kräfte von dieser Region hergestellt werden kann gemessen werden. Ein Vertreter neuronalen Abschleppen Experiment ist in Abbildung 1, wo die abgeschleppt Axon in der Länge wurde in 2 Stunden verdoppelt hat.
Abbildung 1. Ein kultivierter Huhn Spinalganglien Zelle mit der bevorzugten Orientierung für das Abschleppen gewählt wird. Die erste Null-Referenz Abstand zwischen den Nadeln aufgenommen wird, bevor die experimentelle Manipulation beginnt (A). Die "Push up"-Manöver ist, um das Wachstum Kegel (B) angewendet. Abschleppen beginnt mit erhöhter Kraft Laden als durch die Trennung der Nadeln (C) angegeben. Abschleppen ist das Axon erweitert, haben die "horizontale" und senkrecht Ausrichtungen des geschleppten Axon und Arbeitsbedingungen Nadel gute Kraftmessungen (D) erleichtert. Bar = 40 um. Nadelkalibrierung = 6,9 μdyne / um.
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Discussion
Techniken anzuwenden und zu messen zellulärer Kräfte haben eine lange Geschichte 9. Unsere Methode wurde ursprünglich durch die Arbeit von Dennis Bray, der Glas-Nadeln ähnlich wie bei uns zu "schleppen" Neuronen mit einer konstanten Rate über einen motorisierten hydraulische Vorrichtung 10 verwendet motiviert. Es gibt viele alternative Mittel zur Anwendung Kräfte auf Zellen, die zählen: Schrittmotoren 11, magnetische Kügelchen 12, mikrofabrizierten Balken 13 und fließt 14. Letztere sind vergleichbar mit unserem Ansatz, dass die zellulären Sonde ist letztlich gegen einen Biegebalken bekannter Steifigkeit kalibriert und die zellulären Messungen abhängig lichtmikroskopische Beobachtungen. Im Vergleich zu anderen Ansätzen ist der primäre Vorteil unserer Methode 3 die Möglichkeit, gleichzeitig gelten und messen Kräfte in der μdyne Bereich mit Hilfe von Geräten (Mikroskope und Mikromanipulatoren) typisch für Life-Science-Abteilungen.
Mit diesen Methoden, die Kräfte, die durch das neuronale Wachstum Kegel ausgeübt, wie sie vorher waren 15 gemessen. Die mechanische Verbindung der axonalen Dehnrate in Reaktion auf Spannung bestimmt wurde, um eine Newtonsche Flüssigkeit wie Reiz-Reaktions-Beziehung 7 folgen. Die relative Empfindlichkeit der Axone in Reaktion auf Spannung wurde gezeigt, dass mehr für die zentrale Neuronen des Gehirns als bei peripheren Neuronen des Hühnerembryo 2. Zurückziehen von Axonen hat auch schon 7 untersucht. Neurons ohne bestimmte Axone können ihre axonale / dendritischen Polarität durch Anwendung von mechanischen Spannungen 5 gesteuert. In Fibroblasten, die GFP-markierten Aktin oder Tubulin wir direkt visualisiert die Antwort des Zytoskeletts, einfache Befestigung der Nadel sowie seine Reaktion auf Änderungen der Spannung 8. Handy-Anhänge zu einander oder Substrate wurden 1 getestet. Die treibenden Kräfte der bewegliche Zellen könnte untersucht werden, und die Anziehungskraft der nahenden filipodia konnten 16 gemessen werden. Die Bewegungen durch markierte Mitochondrien innerhalb abgeschleppt Axone angezeigt haben zu modellieren internen Materialtransport (mit niedriger Geschwindigkeit Transport) verwendet wurde und feststellen, dass Neuronen, die durch eingelagerte Masse zusätzlich entlang der Länge der Axone Welle 6,17 wachsen.
Für Ermittler einfach in der Anwendung Kräfte ohne Messen sie interessiert, ist die Verwendung des Referenz-Nadel nicht 18 erforderlich. Im Gegensatz dazu, wenn Kraftmessungen gewünscht werden die Referenz Nadel ist unerlässlich, um genaue Daten zu generieren. Insgesamt schätzen wir den Fehler in der absoluten Kraft Messungen im Bereich von 5% bis 10% mit die größte Quelle der entstehende Fehler in den Daten Leseprozess werden. Die Schwierigkeit besteht darin, genau die Beschreibung der Lage der defocused Referenz Nadel und Minimierung der Auswirkungen von kleinen hin und her Bewegungen (Schwingungen) der Nadeln. Ohne einen Hinweis Nadel, wäre diese Fehlerquellen werden noch größer.
Experimentelle Manipulationen müssen nicht am Ende mit dem Abschleppen Sitzung. Towed Wachstum Kegel kann auch auf andere Zellen befestigt werden oder wieder an die Schüssel 5. Mit dieser manipulative Gelegenheit könnte neuronale Mikro-circutry absichtlich so konfiguriert werden, so dass das Übersprechen von verschiedenen Zelltypen untersucht werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns für die wichtigen Beiträge von Dr. Robert E. Buxbaum in der Entwicklung dieser Methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel wire | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega |
| 0.003" Constatan wire | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool |
| fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universal microscope boom stand | Nikon Instruments | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use |
| mechanical micromanipulator | Narishige International | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | |
| Vibraplane isolation table | Kinetic Systems | 1200 series | ours is model 1201-02-12 |
| Ringcubator | Home made (see reference 19) | reference 19, requires updated controller listed below | |
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | inverted microscope, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments | other dissecting microscopes will work |
References
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- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. The Neuron in Tissue Culture. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).
- Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. Rac is required for growth cone function but not neurite assembly. J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).
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