Summary
תיאור של השיטה עבור פרופיל תפקיד המיטוכונדריה בתאים מסופק. הפרופיל המיטוכונדריה שנוצר מספק ארבעת הפרמטרים של הפונקציה המיטוכונדריה כי ניתן למדוד בניסוי אחד: קצב הנשימה הבסיסי, ה-ATP צמודות הנשימה, דליפה פרוטון, ויכולת מילואים.
Abstract
היכולת למדוד את חילוף החומרים הסלולר להבין תפקוד המיטוכונדריה, אפשרה למדענים ברחבי העולם כדי לקדם את המחקר שלהם בהבנת תפקידה של פונקציה המיטוכונדריה בהשמנה, רעילות, סוכרת הזדקנות, סרטן, תפקוד בטיחות לב וכלי דם.
מטבוליזם נייד הוא תהליך של ספיגת המצע, כגון חמצן, גלוקוז, חומצות שומן, גלוטמין ו, ו המרת אנרגיה בהמשך באמצעות סדרה של חמצון מבוקר enzymatically ותגובות הפחתה. התוצאה אלה תגובות ביוכימיות תאיים בייצור של ה-ATP, על שחרורו של תוצרי לוואי חום כימיים, כגון לקטט ו-CO 2 לתוך הסביבה תאיים.
תובנה חשובה המדינה הפיזיולוגיות של תאים, ועל שינוי של מצב של תאים אלה, ניתן להשיג באמצעות מדידת שיעור החמצן הנצרכת על ידי התאים, אינדיקטור הנשימה המיטוכונדריאלי - שיעור צריכת חמצן - או OCR. תאים גם ליצור ATP דרך הגליקוליזה, כלומר: המרה של גלוקוז אל לקטט, עצמאית של חמצן. בבארות תרבותי, חומצת החלב הוא המקור העיקרי של פרוטונים. מדידת חומצת חלב המיוצר בעקיפין באמצעות פרוטונים שוחרר לתוך המדיום תאיים המקיף את התאים, אשר גורם החמצה של המדיום מספק את שיעור Extra-Cellular החמצה - או ECAR.
בניסוי זה, C2C12 תאים myoblast הם זורעים בצפיפות נתון בתא צלחות סיהורס תרבות. צריכת החמצן הבסיסי (OCR) ו - תאיים (ECAR) שיעורי החמצה נמדדים להקים שיעורי הבסיס. התאים אז מטבולית מוטרד שלוש תוספות של תרכובות שונות (ברצף), כי השינוי פרופיל bioenergetic של התא.
Assay זה נגזר בניסוי הקלאסי להעריך המיטוכונדריה ומשמש כמסגרת שבה לבנות ניסויים מורכבים יותר להבנת תפקוד פיזיולוגי הן pathophysiologic של מיטוכונדריה לחזות את היכולת של התאים להגיב על הלחץ ו / או עלבונות.
Protocol
בניסוי זה, C2C12 תאים myoblast הם זורעים בצפיפות נתון בתא צלחות סיהורס תרבות. צריכת החמצן הבסיסי (OCR) ו - תאיים (ECAR) שיעורי החמצה נמדדים להקים שיעורי הבסיס.
1. הזרקת תאים
התאים מטבולית מוטרד שלוש תוספות של תרכובות שונות (ברצף), כי השינוי פרופיל bioenergetic של התא. קבוצה אחת תשמש לשלוט, עם מפעיל תקשורת נוסף בשם "תרכובות" שליטה.
- הזריקה הראשונה היא oligomycin. Oligomycin מעכב את סינתזת ATP על ידי חסימת ערוץ פרוטון של synthase o F חלק ATP (V Complex). במחקר המיטוכונדריה, הוא משמש כדי למנוע מצב 3 (phosphorylating) והנשימה. עם תאים, זה יכול לשמש כדי להבדיל את אחוז צריכת O2 מוקדש סינתזה ATP ואחוז צריכת O2 צורך להתגבר על דליפת פרוטון טבעי על פני קרום המיטוכונדריה הפנימית.
- הזריקה השנייה היא FCCP. FCCP (קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) הוא ionophore כי היא נושאת יונים ניידים. זהו סוכן שיחררה כי זה משבש סינתזה ATP על ידי העברת יוני מימן על פני קרום המיטוכונדריה במקום ערוץ פרוטון של ה-ATP synthase (V Complex). זו קריסה של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה מוביל לצריכה מהירה של אנרגיה וחמצן בלי דור ה-ATP. במקרה זה, הן OCR ו ECAR יגדל, OCR בשל שיחררה ו ECAR כמו תאים הניסיון לשמור על איזון האנרגיה שלהם באמצעות הגליקוליזה ליצירת ATP.
טיפול FCCP ניתן להשתמש כדי לחשב את קיבולת "לחסוך" הנשימה של תאים מוגדר כהפרש בין כמותי OCR מבוקרת מירבית OCR הבסיס הראשוני. הוצע כי החזקת יכולת הנשימה חלק חילוף גם בתנאים של גירוי פיזיולוגי או pathophysiological המקסימלי הוא גורם מרכזי בהגדרת חיוניות ו / או ההישרדות של תאים. היכולת של התאים להגיב ללחץ בתנאים של הביקוש לאנרגיה מוגברת היא בחלקה הגדול מושפע קיבולת bioenergetic של המיטוכונדריה. יכולת זו היא להרתיע bioenergetic-ממוקש על ידי מספר גורמים, כולל היכולת של התא כדי לספק מצע אל המיטוכונדריה ואת היכולת התפקודית של אנזימים המעורבים אלקטרון התחבורה - ב הזריקה השלישית, rotenone, מעכב קומפלקס אני, הוא הוסיף את התאים. זה יכבה הנשימה המיטוכונדריאלי ולאפשר הן שברים המיטוכונדריה ולא המיטוכונדריה לתרום הנשימה להיות מחושב. אחת יהיה לצפות לירידה OCR בשל תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, עם עלייה מקבילה ECAR כתא עובר למצב glycolytic יותר על מנת לשמור על מאזן האנרגיה שלה
Rotenone הוא מעכב המיטוכונדריה שמונע את העברת האלקטרונים ממרכז Fe-S במתחם אני אל ubiquinone (אנזים Q). זה עיכוב של קומפלקס אני מונע את האנרגיה הפוטנציאלית של NADH מלהיות להמיר אנרגיה שימושית בצורה של ה-ATP.
2. ריאגנטים חומרים
- Oligomycin, FCCP, פתרונות Rotenone (סיהורס מבחן מיטו ערכת מתח)
- DMEM ריצה מדיה (סיהורס # 100965-000)
- DMSO (Sigma D8418)
- מים מזוקקים (Gibco 15230-170)
- כיול חוצץ (סיהורס Bioscience)
3. צמיחה בינונית
- 500 מ"ל DMEM (Gibco 11965-092)
- FBS 10% (Hyclone SH90070.03)
- 5 מ"ל פן / סטרפטוקוקוס (Gibco 15140-122)
- 5 מ"ל Pyruvate נתרן (Sigma S8636)
- 5 מ"ל Glutamax (Gibco 35050-061)
4. מתזמן פרוטוקול
- תאים הם זרע XF96 צלחות בתרביות תאים עם 10,000 תאים / היטב μL 100 של מדיום הגידול והושמו 37 ° C חממה עם 10% CO 2.
- תאים תדבק את הצלחת XF96 תרבית תאים תוך שעה 1.
- Assay תאים XF96 24 שעות לאחר זריעה.
5. הכנת תבנית Assay
- באמצעות אשף Assay (נספח א '), ליצור תבנית עם פריסת הקבוצה הבאה:
באיור 1. פריסת רשת ובכן זיהוי משימות טור קבוצה
6. מתחם הכנה
- להכין את תרכובות הבאים XF DMEM Assay התקשורת כדלקמן:
10 Oligomycin אממ, אממ FCCP 30.0, 20.0 Rotenone מיקרומטר,
ריכוזים אלה מייצגים את דילול 10X כי ייעשה כאשר תרכובות מוזרקים לתוך הבאר. ריכוזי העובדים הם:
1 Oligomycin אממ, 3.0 UM FCCP, Rotenone 2.0 מיקרומטר
7. מדיה שינוי הכנה Cell
8. טוען מחסנית חיישן
- תרכובות חם 37 ° C לפני טעינת מחסנית חיישן עומס תרכובות ליציאות מזרק כדלקמן:
- טורים 1-4: טען 16, 18, 20 μL של XF Assay מדיה (DMEM) לתוך היציאות A, B ו-C, בהתאמה.
- עמודות 5-12:
טען 16 μL של Oligomycin לתוך יציאות
טען 18 μL של FCCP לתוך יציאות B
טען 20 μL של Rotenone לתוך יציאות C
9. פרוטוקול פקודות
| פקודה | זמן (דקות) | נמל |
| לדרג | ||
| לאזן | ||
| Loop התחלה | 3X | |
| לערבב | 3 | |
| חכה | 2 | |
| למדוד | 3 | |
| Loop End | ||
| להזריק | ||
| Loop התחלה | 2X | |
| לערבב | 3 | |
| חכה | 2 | |
| למדוד | 3 | |
| להזריק | ב | |
| Loop התחלה | 2X | |
| לערבב | 3 | |
| חכה | 2 | |
| למדוד | 3 | |
| להזריק | ג | |
| Loop התחלה | 2X | |
| לערבב | 3 | |
| חכה | 2 | |
| למדוד | 3 | |
| סוף |
1. טבלת פרוטוקול פקודות
Discussion
Assay זה נגזר הניסוי הקלאסי לחקור תפקוד המיטוכונדריה ומשמש כמסגרת שבה לבנות ניסויים מורכבים יותר להבנת שינויים שונים מטבוליזם התא, תפקוד המיטוכונדריה, ו bioenergetics הכוללת.
תרכובות כל שימוש בניסוי זה צריך להיות מותאם ריכוז המספק את האפקט המרבי. כלומר, יש לבצע ניסויים טיטרציה נפרד לברר את הערכים הללו. זה חשוב במיוחד עם FCCP, כמו עקומת טיטרציה נוטה להיות חריף למדי, FCCP יותר מדי בעצם יכול להפחית תגובות OCR. טווחי אופיינית (ריכוזים הסופי) כדי לבדוק את תהיה:
- 0.1-1.0 UG / mL של Oligomycin
- 0.1-5.0 אממ FCCP
- 0.1-1.0 Rotenone UM
שים לב כי כל התגובות מתחם לעיל (במיוחד FCCP) יושפע הרכב assay התקשורת (סוג הבסיס, [גלוקוז], [pyruvate], נוכחות / היעדרות של BSA, וכו '). יתר על כן, אם הרכב מדיה XF assay משתנה, אופטימיזציה יהיה צורך לבצע מחדש. נוכחות וריכוז pyruvate חשוב במיוחד בהשגת יכולת הנשימה מירבית בשל FCCP. סוסון ים Bioscience יש לצפות במספר שורות תאים השמטה של pyruvate מבטלת את היכולת של התאים להגיב מקסימאלי (מעל הבסיס) כדי FCCP. בדרך כלל, ריכוזי pyruvate mM 1-10 צריך להיבדק כדי להבין את ריכוז אופטימלי של pyruvate להשיג נשימה מקסימאלית. שים לב [pyruvate] ו [גלוקוז] ייתכן שיהיה צורך "לחצות טיטרציה" כדי להשיג את המדיה תנאים אופטימליים עבור הניסוי.
תוצאות אופייניות של ניסוי זה מוצגים להלן גרף המציגים OCR לעומת זמן ועוד זמן מול המראה ECAR:
2. איור OCR זמן לעומת
3. איור ECAR זמן לעומת
כאן ראינו את התגובות הצפויות OCR ו ECAR כמו תאים מטופלים עם כל תרכובת רצופים. עבור oligomycin, OCR פוחתת כתוצאה חסימת סינתזת ה-ATP על קומפלקס המיטוכונדריה V. מכיוון שהתאים אינם מסוגלים לסנתז ATP דרך OXPHOS, הם לחזור הגליקוליזה כדי לענות על הביקוש שלהם עבור ה-ATP, ולכן אנו צופים גידול ECAR. כפי שהראינו לעיל, FCCP פועל כסוכן שיחררה את סוגר. מכיוון שתאי חייב עכשיו להתגבר על דליפת פרוטון על פני קרום המיטוכונדריה הפנימית, OCR מגדילה באופן משמעותי כמו O2 יותר נצרך כדי לשאוב את עודף פרוטונים חזרה דרך הממברנה של המיטוכונדריה. לבסוף, אני מעכב rotenone המיטוכונדריאלי קומפלקס מורכב III, בהתאמה, אשר גורם לזרימת האלקטרונים להפסיק את שרשרת הובלת האלקטרונים, ולכן הצריכה של O2 מצטמצם באופן דרסטי.
איור 4. נשימה פרמטרים
מעבר לשינויים הצפויים הנשימה ECAR, מספר פרמטרים הנשימה ניתן לקבל נתונים אלה. זה מסוכם באיור לעיל:
כאן אנו רואים כי אנו עשויים לקבל מידע על הנשימה הבסיס של התאים, אחוז צריכת O2 מוקדש ייצור ATP, כמו גם את הסכום המוקדש שמירה על שיפוע פרוטון (H + עקב דליפה). יתר על כן, אנו עשויים לקבל את קצב הנשימה מקסימלית בתנאים הנשימה זוגיים (המכונה לעתים יכולת הנשימה כמו חילוף) ולבסוף, אנו יכולים לקבוע את כמות הצריכה O2 לא בשל תהליכי המיטוכונדריה.
מספר הולך וגדל במהירות של מחקרים הם המעסיקים את הפרופיל של המיטוכונדריה להעריך bioenergetics הסלולר, לזהות תפקוד המיטוכונדריה ו לחזות את היכולת של התאים להגיב על הלחץ ו / או עלבונות. למידע ופרטים נוספים על שיטה זו ניסיוניים את הרעיון של יכולת הנשימה חילוף, ראה להפנות את הפרסומים הבאים 1-8.
Disclosures
מינימום וו, לעמוד בו ג'נסן, ג'ורג' וו רוג'רס, ודוד א Ferrick עובדים של סוסון ים Bioscience, המייצרת ריאגנטים ומכשור הוצגו במאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions | Seahorse Bioscience | Seahorse Mito Stress Test Kit | |
| DMEM Running Media | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Distilled Water | GIBCO, by Life Technologies | 15230-170 | |
| Calibration buffer | Seahorse Bioscience |
References
- Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
- Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
- Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
- Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
- Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor. Biochem J. 428, 255-267 (2010).
- Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
- Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell. , 142-142 (2010).
