Summary
Bu video, floresan etiketli PKC kullanarak canlı hücreler PKC translokasyonu görselleştirme göstermektedir.
Abstract
Protein kinaz Cs (PKC) gibi hücre büyüme ve öğrenme ve hafıza gibi çok çeşitli hücre süreçlerini düzenleyen merkezi bir rol oynayan treonin kinazlar serin. Omurgalıların PKC izoformlarını dört anılan aileler bulunmaktadır: klasik PKC (α, βI, βII ve γ), yeni tip I PKC (ε η), yeni tip II PKC (δ ve θ) ve atipik PKC (ζ ve ι .) Klasik PKC Ca 2 ile aktive olan roman PKC DAG aktif, ancak Ca 2 +-bağımsız iken + ve diacylclycerol (DAG). Atipik PKC + ne DAG Ca 2 ne tarafından aktive edilir. Aplysia californica, bellek oluşumunu incelemek için model sistem olmak üzere üç sinir sistemine özgü PKC izoformlarını her ana sınıfı, geleneksel PKC Apl Ben, roman türü PKC Apl II ve atipik PKC Apl III vardır . PKC lipid aktive kinazlar ve böylece ekstrasellüler sinyaller yanıt klasik ve yeni PKC aktivasyonu sık sık, plazma zarı sitoplazmaya PKC translokasyonu ile korele olmuştur. Bu nedenle, canlı hücreler gerçek zamanlı PKC translokasyonu görüntülenmesi PKC aktivasyonuna yol açan sinyal iletim yolları nedenlerine açıklık için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Örneğin, bu tekniğin farklı PKC izoformlarını sinaptik plastisite farklı tip arabuluculuk için farklı koşullar altında yerini değiştirmek ve II. PKC Apl bu serotonin (5HT) aktivasyonu için hem DAG ve phosphatidic asit (PA) üretim gerektirir kurmak için bize izin verdi translokasyon 1-2. Önemlisi, aynı nöron görselleştirmek için yeteneği sürekli olarak bize, örneğin, en ince ayrıntısına kadar 3 PKC yanıt duyarsızlaştırma ölçmek için izin verdi . Bu video Sf9 hücre kültürlerinin hazırlanmasında her adımı gösteren, Aplysia duyusal nöronlar kültürleri yanıt olarak floresan etiketli PKC ifade Sf9 hücreleri ve Aplysia duyusal nöronlar ve PKC translokasyonu canlı görüntüleme, başka bir video 4 üncü maddesinde tarif edilmiştir lazer tarama mikroskopisi kullanarak farklı aktivatörleri.
Protocol
1. Hazırlık ve Sf9 Hücre Monolayer Kültürler Bakım
- Bir doku kültürü kaputu Sf9 hücre kültürü ve bakım yapılır.
- Sf9 hücreleri Spodoptera frugiperda yumurtalık hücreleri (Sf21 hücre) türetilmiştir ve Invitrogen Grace medya donmuş hücreleri olarak satın alınabilir.
- Yeri 8 mL takviye Grace böcek, orta (1X),% 30 fetal sığır serumu (FBS) eğimli bir boyun ile 75 cm 2 hücre kültürü şişesi eklenmiştir.
- 37 ° C su banyosunda hızla (yaklaşık 1-2 dakika), ileri ve geri tüp hareket Sf9 hücreler dondurulmuş tüp çözülme.
- Hücreler eşit olarak dağıtmak için elle hafifçe Sf9 hücreler 75 cm 2 hücre kültürü şişesi ve taş plaka transfer.
- Hücreleri bağlı 27 ° C kadar 1-2 saat inkübe edin.
- Eski orta çıkarın ve% 30 FBS freshGrace böcek orta 10 ml ile değiştirin.
- Konfluent hücreleri 27 ° C kadar inkübe edin.
- Tek tabaka kültürleri korumak için, eski orta Sf9 hücrelerinin konfluent balon kaldırmak ve 5 ml% 10 FBS Grace böcek orta ekleyin.
- Balonun tarafında Sf9 hücreleri ayırmak için birkaç kez hafifçe dokunun.
- Pipet, bir kez hafifçe aşağı pipetleme sırasında balon duvar püskürtme, yukarı ve aşağı 10 ml pipet ve bir pipet medya kullanımı. 15 ml steril bir polysterene tüp hücreleri aktarın.
- El ile yavaşça 75 cm 2 yeni hücre kültürü şişesi ve taş plaka% 10 FBS (log fazı büyüme sağlamak için seyreltme 01:05) ile Grace böcek orta 8 mL, Sf9 hücre süspansiyonu 2 mL ekleyin .
- Konfluent hücreleri 27 ° C kadar inkübe edin.
2. Sf9 Hücreler floresan Takip edilen PKC İfadesi
- Canlı görüntüleme deney, kültür 35 mm Mattek cam alt kültür disheswith cam yüzey 14 mm ve 0,16 - 0,19 mm lamel kalınlığı bir Sf9 hücre.
- Floresan proteinleri ile etiketlenen PKC aşağıda ayrıntılı değişiklikler ile üreticinin Cellfectin II transfeksiyon reaktif aşağıdaki tavsiye Sf9 hücreleri kullanılarak ifade edilir.
- 1. Gün: hücrelerin kaplama önce, en az 30 dakika süreyle% 10 FBS Grace böcek orta her Mattek çanak tedavi.
- Hemasitometre kullanarak adım 11 (üstte) Sf9 hücreleri sayın.
- Plaka 0.05 x 10 6 hücre toplam hacmi 150 mcL her Mattek cam lamel. Hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca takmak için izin verin.
- Grace hücreleri koparmasını önlemek için yavaş yavaş bir anda her çanak 1 ml% 10 FBS ile takviye 2 mL ekleyin.
- 27 ° C'de bir gece inkübe edin.
- Bu noktadan itibaren, plazmid DNA ile Sf9 hücre transfeksiyon için üretici firmanın tavsiye kullanın.
- 2. Gün: Cellfectin II transfeksiyon reaktif kullanarak floresan etiketli PKC Transfect Sf9 hücreleri. Biz genellikle gelişmiş Yeşil Floresan Protein (eGFP) ve monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) (plazmid inşaat için daha önce 2,5 tarif edilmiştir) ile etiketlenen bu sistem PKC eş dile getirdiler. İfade bir defada bir floresan protein% 70-80 hakkında ifade hücreler 72 saat sonrası transfeksiyon verir. Co-iki floresan proteinleri ifade transfeksiyon verimliliği yaklaşık% 30 co-ifade hücreleri azalır. EGFP etiketli PKC ve MRFP etiketli PKC co-ifade edilirken, optimum protein ekspresyonu için MRFP etiketli protein daha plazmid DNA 2x kullanın.
- Gerçekleştirin canlı görüntüleme 48-72 saat sonrası transfeksiyon (optimal protein ekspresyonu, 72 saat bekleyin).
3. Aplysia Duyu Nöronlar floresan Takip edilen PKC Açıklanması
- Zhao ve meslektaşları 4 video makalede açıklanan Aplysia nöronal hücre kültürlerinin hazırlanması olmuştur.
- Floresan proteinleri ile etiketlenen PKC Aplysia duyusal nöronlar aşağıda ayrıntılı mikroenjeksiyon yordamı kullanarak ifade edilir.
- Distile su içinde% 1 Hızlı Yeşil (FCF) stok solüsyonu hazırlayın, bir şırınga ve 28 mm şırınga filtresi (0.20 mikron) filtresi. -20 ° C'de kısım ve mağaza
- Duyu nöronlarının Mikroenjeksiyon nöronlar izole sonra günde 1 veya 2 günde ancak 2 gün bekledikten lamel daha iyi hücre bağlılık sağlar olabilir.
- Duyu nöronlarının izolasyon sonra, günde 2 Hızlı Yeşil bir kısım Çözülme ve bir şırınga ve 28 mm şırınga filtresi (0.20 mikron) kullanarak tekrar filtre.
- Distile su içinde% 0.5 Hızlı Yeşil içeren plazmid DNA bir çözüm hazırlayın. Mcg / ml 0.4 gibi yüksek bir plazmid DNA konsantrasyonları kullanılabilir ama bu değerlerin üstünde gitmek için tavsiye edilmez.
- Filtre 1 ml şırınga ve 4 mm'lik bir şırınga filtresi (0.20 mikron) kullanarak plazmid DNA / Hızlı Yeşil çözüm.
- Bir mikrofon kullanarak 15 dakika boyunca 16.110 xg'de plazmid DNA / Hızlı Yeşil çözüm Santrifüjrocentrifuge.
- Mikroelektrot çektirmenin kullanarak nöronlar mikroenjeksiyon (Sutter Flaming / Brown Mikropipet Çektirme, Model P-97) keskin elektrotlar hazırlayın. 1 mm dış çapı, iç çapı 0.75 mm ve 100 mm uzunluğunda içinde filament (Dünya Hassas Aletler TW100F-4) ile ince cidarlı cam kapilerleri kullanarak cam bir kutu filament kullanarak, Mikroelektronlar çekin. Sutter elektrot yemek kitabı mikroenjeksiyon elektrotlar çekme hakkında daha fazla bilgi için bakınız.
- Microloader pipet ucu (Eppendorf CA32950-050) kullanarak plazmid DNA / Hızlı Yeşil çözüm 2 mcL her elektrot doldurun.
- Mikroenjeksiyon istasyonu Aplysia nöronal kültürlerin içeren Mattek cam alt kültür kaplarına aktarın.
- Mikroenjeksiyon istasyonu aşağıdakilerden oluşur: bir ev yapımı bir titreşim izolasyonu tablosu (Kinetik Sistemleri titreşim izolasyonu iş istasyonu), dış halojen aydınlatma ile stereo kapsam mikromanipülatör (Sutter Huxley Duvar Tipi Mikromanipülatör kültür yemekleri tutmak için büyük cam aşamasında olan) üç eksen kaba ve ultra-ince konumlandırma sağlar, pnömatik pompa (Dünya Hassas Aletler PV820 Pnömatik Pico-Pompa) bağlı bir mikroelektrot sahibi. Pnömatik pompa basıncı Giriş sıkıştırılmış bir Azot tankına bağlı.
- Mikroelektrot mikroelektrot tutucu içine yerleştirin.
- Stereo-mikroskop altında görüntülenen, hücre çekirdeği içine mikropipet ucuna takın.
- Azot kısa basınç darbeleri sunun (10 ila 100 ms süresi, 20 lb / 2) çekirdeğin düzgün olarak yeşil olana kadar.
- Hücreleri 4 saat oda sıcaklığında inkübe edin ve 4 ° C kullanana kadar az tutmak. Enjeksiyon sonrası 24 saat optimum PKC translokasyonu için canlı görüntüleme deney 20 gerçekleştirin.
4. Sf9 Hücreler Yaşayan ve Aplysia Duyu Nöronlar PKC Translokasyon Görselleştirme
- Görüntüleme için, biz bir Axiovert 200 ile Zeiss LSM510 ters konfokal mikroskop kullanıyoruz.
- Aplysia duyusal nöronlar x40 immersiyon yağı hedefi ile görüntülü ise Sf9 hücreleri X63 immersiyon yağı hedefi imaged: Görüntüleme protokolü Sf9 hücreler ve Aplysia duyusal nöronlar için aşağıdaki hariç aynıdır. Aplysia duyusal nöronlar, 18-20 o C civarında muhafaza oda sıcaklığında görüntülü ise Sf9 hücrelerin bakımı, 26-27 o C sıcaklık kontrollü bir odasında görüntülü
- % 50 lazer çıktı eGFP protein ve MRFP protein ile görüntü etiketledi PKC HeNe lazer (543nm azından uyarma) etiketli görüntü PKC 30 mW Argon lazer (488nm az eksitasyon). Argon ve HeNe lazer çizgileri% 4 oranında azaltılmış ve görüntüleme ve iğne deliği önce sırasıyla% 50 iletim çıkışı bir şekilde ayarlanır.
- Kültür çanak görüntüleme sahnede stabilize olması ve hareket veya titreşim önlemek için önemlidir.
- Yavaşça bırakarak bir tabak içinde 1 ml toplam hacmi 10 mL pipet kullanarak çanak 1 ml kültür ortamı çıkarın.
- Çekirdeğin görülebilir hücrelerinin orta bölümünde fotoğraflar çekin.
- Her 30 saniyede bir resim alarak 10-20 konfokal görüntüleri bir zaman serisi ayarlayın.
- Zaman serisi başlayın.
- 2 resim (30 saniye noktadan sonra) alındıktan sonra, yavaşça ilacın 1 ml (2X konsantrasyon) P1000 bir pipet kullanarak hücrelerin üstüne bırak bırak ekleyin. Ilaç yaklaşık 30 saniye boyunca sürekli olarak eklenir.
- Bazı ilaçlar, diğerleri sadece en iyi 5-10 dakika tedavi sonrası (Film 1 ve Movie 2) yavaş bir translokasyon neden while (60 saniye noktada) hemen sonra ilaç tedavisi görülebilir hızlı bir translokasyona neden olur.
- Ilaç yıkanıp gerekiyorsa, çanağı bir tarafta bir pipet yardımıyla hafifçe aşağı yıkama tamponu pipetleme ve diğer tarafta medya pipeting yıkama yapmak için 2 x 10 ml pipetler kullanabilirsiniz.
- Yıkama etkili olmuştur ve ilacın etkisi geri dönüşümlü olup olmadığını, KZÇ sitoplazmada 30-60 saniye içinde geri döner.
- Film LSM bir dosya olarak kaydedin.
- LSM dosyaları açmak ve görüntüleri öncesi ve sonrası ilaç tedavisi ölçmek için NIH Image J yazılımı kullanın. Niceleme başka bir yerde 1 tarif edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz Sf9 hücreleri ve Aplysia duyu nöronları gerçek zamanlı olarak floresan etiketli PKC görüntü translokasyon bir teknik tanımlanmıştır. Kültür ve onları transfecting oldukça düz ileri olduğundan Sf9 hücreleri görüntü PKC translokasyonu basit bir sisteme de sağlar. Aksine, Aplysia duyu nöronlarının mikroenjeksiyon master için biraz zaman alır; birkaç ay. Bu tekniği ile ilgili güçlükler elektrot tıkanma içerir. Enjeksiyon çözüm Filtreleme ve santrifüj genellikle yardımcı olur, ancak o kadar dolum esnasında elektrot bazen hava kabarcıkları oluşabilir. Biz yerine kapilarite elektrot doldurmak için Microloader pipet uçları kullanarak hava kabarcıklarının oluşumunu en aza indirmek için yardımcı olduğunu bulabilirsiniz. Canlı görüntüleme ile ilgili olarak, iki faktöre görüntüleme oturumu sırasında sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekir: sıcaklık ve hareket. Sıcaklık dalgalanmaları translokasyon etkileyebilecek ve ısı kontrollü bir odasının kullanılması düşünülmelidir. Görüntüleme sırasında hareket önlemek için, bir titreşim izolasyonu tablosu kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Hibe Wayne S. Sossin Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Carole A. Farah de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ve bir Conrad Harrington dostluk Viyana bir doktora sonrası dostluk alıcı. Yazarlar Joanna buji, Margaret Hastings ve Margaret Labban grafik genel yardım için video çekimi ve Madeline Richmond Havuzu ile ilgili yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Use to make micr–lectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Micr–lectrode holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Use to hold micr–lectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Use to position micr–lectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
