Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

Summary

In deze video laten we zien visualisatie van PKC translocatie in levende cellen met behulp van fluorescent gelabelde PKCS.

Abstract

Protein kinase Cs (PKCS) zijn serine threonine kinasen die een centrale rol spelen in het reguleren van een breed scala van cellulaire processen zoals celgroei en leren en geheugen. Er zijn vier bekende families van PKC isovormen in vertebraten: klassieke PKCS (α, βI, βII en γ), nieuwe type I PKCS (ε en η), nieuw type II PKCS (δ en θ), en atypische PKCS (ζ en ι ). De klassieke PKCS worden geactiveerd door Ca ^{2 +} en diacylclycerol (DAG), terwijl de roman PKCS worden geactiveerd door DAG, maar zijn Ca ^{2 +-onafhankelijk.} De atypische PKCS worden geactiveerd door geen van beide Ca ^{2 +} of DAG. In Aplysia californica, ons model systeem om geheugenvorming studeren, zijn er drie zenuwstelsel specifieke PKC isovormen een van elke grote klasse, namelijk de conventionele PKC Apl I, de roman type I PKC Apl II en de atypische PKC Apl III. PKCS zijn lipide-geactiveerde kinasen en dus de activering van klassieke en nieuwe PKCS in reactie op extracellulaire signalen is vaak gecorreleerd met PKC translocatie vanuit het cytoplasma naar de plasmamembraan. Daarom heeft het visualiseren van PKC translocatie in real-time in levende cellen worden een waardevol hulpmiddel voor het ophelderen van de signaaltransductiewegen die leiden tot PKC activering. Zo heeft deze techniek mogelijk voor ons om vast te stellen dat de verschillende isovormen van PKC transloceren onder verschillende omstandigheden op verschillende soorten van synaptische plasticiteit bemiddelen en dat serotonine (5HT) activering van PKC Apl II vereist productie van zowel DAG en fosfatidinezuur (PA) voor de translocatie ^1-2. Belangrijk is dat de mogelijkheid om dezelfde neuron te visualiseren heeft herhaaldelijk ons toegestaan, bijvoorbeeld om desensitisatie van de PKC respons in verfijnde details maatregel ^3. In deze video, we elke stap van de voorbereiding Sf9 celculturen tonen, hebben culturen van Aplysia sensorische neuronen zijn beschreven in een ander video-artikel ^4, uiten van fluorescent gelabelde PKCS in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen en live-imaging van PKC translocatie in reactie op verschillende activatoren met behulp van laser-scanning microscopie.

Protocol

1. Voorbereiding en onderhoud van Sf9 Cell monolaagculturen

1. Sf9 celcultuur en het onderhoud wordt uitgevoerd in een weefselkweek kap.
2. Sf9-cellen zijn afgeleid van Spodoptera frugiperda ovariële cellen (Sf21 cellen) en kunnen worden gekocht als bevroren cellen in Grace's media van Invitrogen.
3. Plaats 8 ml van insecten medium Grace's, aangevuld met (1X), waaraan 30% foetaal bovine serum (FBS) is toegevoegd in een 75 cm ² celkweek kolf met een gekanteld nek.
4. Snel Ontdooi de bevroren buis van Sf9 cellen in een 37 ° C waterbad door het bewegen van de buis heen en weer (ongeveer 1-2 minuten).
5. Overdracht Sf9 cellen om de 75 cm ² celkweek kolf en rock-plaat voorzichtig met de hand gelijkmatig te verdelen de cellen.
6. Incubeer 1-2 uur bij 27 ° C tot cellen hebben bevestigd.
7. Verwijder de oude medium en te vervangen door 10 ml van insecten medium freshGrace met 30% FBS.
8. Incubeer bij 27 ° C totdat de cellen confluent.
9. Te onderhouden monolaagculturen, verwijder de oude medium van de samenvloeiing van de fles Sf9 cellen en voeg 5 ml van de insecten medium Grace's met 10% FBS.
10. Licht te tikken op de zijkant van de kolf meerdere keren Sf9-cellen los te maken.
11. Met behulp van een pipet van 10 ml en een pipet, de media pipet op en neer een keer voorzichtig, spuiten fles muur terwijl pipetteren naar beneden. Overdracht van de cellen in een steriele 15 ml polystyreen buis.
12. Voeg 2 mL van Sf9 celsuspensie tot 8 ml van insecten medium Grace's met 10% FBS (1:5 verdunning om in te loggen fase groei te handhaven) in het nieuwe 75 cm ² celkweek kolf en rock-plaat voorzichtig met de hand.
13. Incubeer bij 27 ° C totdat de cellen confluent.

2. Expressie van fluorescent gelabeld PKCS in Sf9 cellen

1. Voor live-imaging experiment, cultuur Sf9 cellen op 35 mm MatTek glazen bodem cultuur disheswith een glazen oppervlak van 14 mm en een dekglaasje dikte van 0,16 tot 0,19 mm.
2. PKCS getagd met fluorescerende eiwitten worden uitgedrukt in Sf9 cellen met behulp van Cellfectin II transfectiereagens volgende aanbeveling van de fabrikant met de wijzigingen die hieronder worden beschreven.
3. Dag 1: Voorafgaand aan de beplating van de cellen, elk MatTek gerecht te behandelen met insect medium Grace's met 10% FBS voor ten minste 30 minuten.
4. Count Sf9 cellen van stap 11 (boven) met behulp van een hemacytometer.
5. Plaat 0,05 x 10 ⁶ cellen op elke MatTek glas dekglaasje in een totaal volume van 150 ul. Laat de cellen te hechten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
6. Voeg 2 mL van Grace's met 10% FBS aangevuld bij elk gerecht een ml per keer langzaam om te voorkomen dat het losmaken van de cellen.
7. Incubeer bij 27 ° C gedurende de nacht.
8. Vanaf dit punt, gebruik van de fabrikant aanbeveling voor de transfectie van Sf9 cellen met plasmide DNA.
9. Dag 2: transfecteren Sf9 cellen met fluorescent gelabelde PKCS met behulp van Cellfectin II transfectiereagens. We hebben vaak samen, uitgedrukt in dit systeem PKCS getagd met verbeterde Green Fluorescent Protein (EGFP) en monomere Red Fluorescent Protein (mRFP) (details voor plasmide bouw zijn eerder beschreven ^2,5). Expressie van een fluorescerend eiwit in een tijd levert ongeveer 70-80% tot expressie brengen 72 uur na transfectie. Co-expressie van twee fluorescerende eiwitten af ​​transfectie-efficiëntie tot ongeveer 30% co-expressie cellen. Wanneer eGFP-gelabeld PKC en mRFP-tagged PKC co-expressie, gebruik 2x meer plasmide DNA voor de mRFP-gelabeld eiwit voor een optimale eiwit-expressie.
10. Live-imaging 48-72 uur na transfectie (voor een optimale eiwit-expressie, wacht dan 72 uur).

3. Expressie van fluorescent gelabeld PKCS in Aplysia sensorische neuronen

1. De voorbereiding van Aplysia neuronale celkweken is beschreven in een video-artikel van Zhao en collega's ^4.
2. PKCS getagd met fluorescerende eiwitten worden uitgedrukt in Aplysia sensorische neuronen met behulp van micro-injectie procedure hieronder beschreven.
3. Bereid een voorraad oplossing van 1% Fast Groen (FCF) in gedestilleerd water, filter met behulp van een spuit en een 28 mm spuitfilter (0,20 pm). Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
4. Micro-injectie van de sensorische neuronen kan worden uitgevoerd op dag 1 of 2 dagen na het isoleren van de neuronen, maar we vinden dat het wachten twee dagen zorgt voor een betere naleving van de cel dekglaasje aan.
5. Op dag 2 na isolatie van de sensorische neuronen, dooi een hoeveelheid van Fast Green en opnieuw filter met behulp van een spuit en een 28 mm spuitfilter (0,20 pm).
6. Bereid een oplossing van plasmide DNA in gedestilleerd water met 0,5% Fast Green. Concentraties van plasmide DNA zo hoog als 0,4 ng / ul gebruikt kan worden, maar het is niet aan te raden om te gaan boven deze waarden.
7. Filter het plasmide DNA / Fast 'groene oplossing' met een 1 ml spuit en een 4 mm spuitfilter (0,20 pm).
8. Centrifugeer het plasmide DNA / Fast 'groene oplossing' op 16.110 xg gedurende 15 minuten met behulp van een microfoonrocentrifuge.
9. Bereiden op scherp elektroden voor micro-injectie van de neuronen met behulp van een micro-elektrode trekker (Sutter Flaming / bruin Micropipet Puller, Model P-97). Met behulp van een doos gloeidraad, trek glazen micro-elektroden met 1 mm buitendiameter, 0.75 mm binnen diameter en 100 mm lengte met behulp van dunne wand glazen capillairen met een filament binnenin (World precisie-instrumenten TW100F-4). Voor meer informatie over het trekken van micro-injectie elektroden verwijzen wij u naar Sutter elektrode kookboek.
10. Vul elke elektrode met 2 pl van plasmide DNA / Fast 'groene oplossing' met behulp van microloader pipetpunt (Eppendorf CA32950-050).
11. Breng de MatTek glazen bodem cultuur schotel met Aplysia neuronale culturen tot de micro-injectie station.
12. De micro-injectie station bestaat uit de volgende: een home-made grote glazen podium om de cultuur gerechten te houden op een trillingsisolatie tafel (Kinetic Systems trillingsisolatie workstation), een stereo-scope met externe halogeen verlichting, een micromanipulator (Sutter Huxley muur Type micromanipulator die het mogelijk maakt zowel grof-en ultrafijne positionering in de drie-as), een micro-elektrode houder is aangesloten op een pneumatische pomp (World precisie-instrumenten PV820 Pneumatische Pico-pomp). De druk Ingang van de pneumatische pomp is aangesloten op een gecomprimeerde stikstof tank.
13. Steek een micro-elektrode in de micro-elektrode houder.
14. Weergave in een stereo-microscoop, steek de punt van de micropipet in de celkern.
15. Lever korte druk pulsen van stikstof (10 tot 100 ms in de duur, 20 lb / in ²⁾ tot aan de kern wordt uniformely groen.
16. Incubeer de cellen gedurende 4 uur bij kamertemperatuur en houd bij 4 ° C tot gebruik. Voor een optimale PKC translocatie, uit te voeren live-imaging experiment 20 tot 24 uur na de injectie.

4. Visualisatie van PKC Translocatie in Living Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

1. Voor beeldvorming, gebruiken we een Zeiss LSM510 omgekeerde confocale microscoop met een Axiovert 200.
2. Imaging-protocol is hetzelfde voor Sf9 cellen en voor Aplysia sensorische neuronen met uitzondering van het volgende: Sf9 cellen zijn afgebeeld met een X63 olie-immersie objectief terwijl Aplysia sensorische neuronen worden afgebeeld met een x40 olie-immersie objectief. Sf9-cellen worden afgebeeld in een temperatuur-gecontroleerde ruimte gehandhaafd bij 26-27 ^° C, terwijl Aplysia sensorische neuronen worden afgebeeld op kamertemperatuur gehouden rond 18-20 ^° C.
3. We maken gebruik van een 30 mW Argon laser (excitatie bij 488nm) met 50% laser-uitgang om de afbeelding PKC getagd met eGFP eiwit en een HeNe laser (excitatie bij 543nm) om de afbeelding PKC getagd met mRFP eiwit. De Argon en HeNe laserlijnen zijn verzwakt tot 4% en 50% transmissie-uitgang met respectievelijk voorafgaand aan de beeldvorming en het pinhole wordt aangepast tot een.
4. Het is belangrijk om de cultuur schotel gestabiliseerd op het imaging podium te hebben en om beweging of trillingen te voorkomen.
5. Verwijder 1 ml van de cultuur media uit de schotel voorzichtig met een pipet van 10 ml verlaten van een mL totaal volume in de schaal.
6. Foto's nemen in het middelste gedeelte van de cellen, waar de kern kan worden gezien.
7. Het opzetten van een tijdreeks van 10-20 confocale beelden maken van een foto om de 30 seconden.
8. Start de tijdreeks.
9. Na 2 foto's zijn genomen (na de 30 seconden tijdstip), voeg 1 ml van het geneesmiddel (2X concentratie) voorzichtig drop-door-drop op de top van de cellen met behulp van een pipet P1000. De drug wordt continu toegevoegd voor ongeveer 30 seconden.
10. Sommige geneesmiddelen veroorzaken een snelle translocatie die onmiddellijk kunnen worden zichtbaar na de behandeling met geneesmiddelen (op het 60 seconden tijdstip), terwijl andere leiden tot een langzame translocatie die slechts optimaal 5-10 minuten na de behandeling (Film 1 en Film 2).
11. Indien het geneesmiddel moet worden weggespoeld, gebruik van 2 x 10 mL pipetten om de was te doen, pipetteren de wasbuffer voorzichtig naar beneden met een pipet aan de ene kant van de schotel en pipetteren de media aan de andere kant.
12. Als het wassen effectief is geweest en als het effect van het geneesmiddel is omkeerbaar, PKC keert terug naar het cytosol binnen 30-60 seconden.
13. Sla de film als een LSM-bestand.
14. Gebruik NIH Image J software om de LSM bestanden te openen en de beelden voor en na de behandeling met geneesmiddelen te kwantificeren. Kwantificering is elders ^een beschreven.

Discussion

We hebben een techniek beschreven om de afbeelding translocatie van fluorescent gelabelde PKCS in real-time in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen. Sf9-cellen zorgen voor een eenvoudig systeem om de afbeelding PKC translocatie sinds het kweken en transfecteren ze is vrij straight-forward. In tegenstelling tot micro-injectie van Aplysia sensorische neuronen kost wat tijd te beheersen, tot een paar maanden. Moeilijkheden in verband met deze techniek ook elektrode verstopping. Het filteren van de injectie-oplossing en centrifugatie het meestal helpt, maar soms luchtbellen kan vormen in de elektrode tijdens het vullen het op. We vinden dat het gebruik van de microloader pipetpunten te vullen van de elektrode in plaats van capillariteit helpt bij het minimaliseren van de vorming van luchtbellen. Ten aanzien van live-imaging, twee factoren moeten goed worden gecontroleerd tijdens de opnamesessie: temperatuur en beweging. Temperatuurschommelingen van invloed kunnen zijn translocatie en het gebruik van een temperatuur-gecontroleerde ruimte dient te worden overwogen. Om te voorkomen dat beweging tijdens beeldvorming, kan een trilling isolatie tafel worden gebruikt.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sf9 frozen cells	Spodoptera frugiperda ovarian cells	Invitrogen	B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11605-094	Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask	Tool	Corning	430720	Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum	Reagent	CanSera	CS-C08-500	Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe	Tool	BD Biosciences	309604	Use to filter Fast Green solution
Syringe	Tool	BD Biosciences	309602	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431229	Use to filter Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431212	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish	Tool	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent	Reagent	Invitrogen	10362-100	Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F-7252	Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Use to make micr–lectrodes for microinjection
Microloader pipette tip	Tool	Eppendorf	CA32950-050	Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump	Tool	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Part of microinjection station
Micr–lectrode holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Use to hold micr–lectrode
Micromanipulator	Tool	Sutter Instrument Co.	MP-85	Use to position micr–lectrode in the three-axis