Summary
В этом видео, мы демонстрируем визуализации PKC транслокации в живых клеток с использованием флуоресцентной меткой PKCS.
Abstract
Протеинкиназа Cs (PKCS) являются серин треонин киназы, которые играют центральную роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как рост клеток и обучения и памяти. Есть четыре известных семейств PKC изоформ у позвоночных животных: классический PKCS (α, Pi, βII и γ), новый тип я PKCS (ε и η), новый тип II PKCS (δ и θ), и атипичная PKCS (ζ и ι ). Классическая PKCS активируются Са 2 + и diacylclycerol (DAG), в то время романа PKCS активируются DAG, но Са 2 +-независимой. Атипичные PKCS активируются ни Са 2 +, ни DAG. В Aplysia californica, наша модель системы для изучения формирования памяти Существуют три нервной системы конкретного PKC изоформы по одному от каждой основной класс, а именно: обычные PKC Apl я, новый тип я PKC Apl II и атипичных PKC Apl III. PKCS это липидные активированной киназы и, таким образом активация классического романа и PKCS в ответ на внеклеточные сигналы неоднократно коррелирует с РКС транслокация из цитоплазмы в плазматическую мембрану. Таким образом, визуализируя PKC транслокации в режиме реального времени в живых клетках стал бесценным инструментом для выяснения сигнальных путей, которые ведут к активации ПКС. Например, этот метод позволил нам установить, что различные изоформы PKC перемещать в различных условиях посредничество различных типа синаптической пластичности и серотонина (5НТ) активация PKC Apl II требует производства как DAG и фосфатидной кислоты (PA) для транслокация 1-2. Важно отметить, что способность визуализировать же нейрон неоднократно позволило нам, например, для измерения десенсибилизации PKC ответ в изысканными деталями 3. В этом видео, мы демонстрируем каждый шаг подготовки Sf9 клеточных культур, культур Aplysia сенсорные нейроны были описаны в другой видео статьи 4, выражая флуоресцентно меткой PKCS в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов и жить-изображений PKC транслокации в ответ на различных активаторов использованием лазерной сканирующей микроскопии.
Protocol
1. Подготовка и обслуживание Sf9 культурах клеток монослоя
- Sf9 культуре клеток и техническое обслуживание выполняется в капот культуры ткани.
- Sf9 клетки получены из Spodoptera frugiperda яичников клеток (Sf21 клеток) и могут быть приобретены как замороженные клетки в средствах массовой информации Грейс из Invitrogen.
- Место 8 мл насекомых среду Грейс, дополненная (1X), к которому 30% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) была добавлена в 75 см 2 клеточной культуре колбу с наклонным шеи.
- Оттепель замороженных трубки Sf9 клетки быстро в 37 ° С водяной бане, перемещая зонд вперед и назад (около 1-2 минут).
- Передача Sf9 клетки 75 см 2 ячейка колбу культуры и рок-пластинка аккуратно от руки, чтобы распространять клетки равномерно.
- Инкубируют 1-2 часа при 27 ° С до клетки прилагается.
- Удалить старые средние и заменить 10 мл насекомых среду freshGrace с 30% FBS.
- Инкубировать при 27 ° С до клетки вырожденная.
- Для поддержания монослоя культуры, удалить старые среды от сливной колбу Sf9 клеток и добавьте 5 мл насекомых среду Грейс с 10% FBS.
- Слегка нажмите на стороне колбу несколько раз, чтобы отделить Sf9 клеток.
- Использование 10 мл пипетки и пипетки, пипетка средств массовой информации вверх и вниз, когда-то нежно, опрыскивание стенке колбы пипеткой в то время как вниз. Передача клетки стерильные 15 мл полистирола трубки.
- Добавить 2 мл клеточной суспензии Sf9 до 8 мл насекомых среду Грейс с 10% FBS (1:5 разбавления для поддержания темпов роста логарифмической фазы) в новом 75 см 2 ячейка колбу культуры и рок-пластинка аккуратно от руки.
- Инкубировать при 27 ° С до клетки вырожденная.
2. Выражение флуоресцентно меткой PKCS в Sf9 Клетки
- Для живого изображения эксперимент, культуры Sf9 клеток на 35 мм Маттек со стеклянным дном культуры disheswith поверхности стекла от 14 мм и толщина покровного 0,16 до 0,19 мм.
- PKCS помеченные флуоресцентными белками выражаются в Sf9 клеток Cellfectin II трансфекции реагента следующие рекомендации производителя с изменениями, подробно описаны ниже.
- День 1: Перед покрытием клетки, лечить каждое блюдо Маттек с насекомыми среду Грейс с 10% FBS, по крайней мере 30 минут.
- Граф Sf9 клеток, начиная с шага 11 (выше), используя hemacytometer.
- Пластина 0,05 х 10 6 клеток на каждом покровное Маттек стекла в общем объеме 150 мкл. Разрешить клетки приложить на 30 минут при комнатной температуре.
- Добавить 2 мл Грейс с добавлением 10% FBS к каждому блюду 1 мл за один раз медленно, чтобы избежать отключения клеток.
- Инкубировать при 27 ° С в течение ночи.
- С этой точки зрения, использовать рекомендации производителя для трансфекции клеток с Sf9 плазмидной ДНК.
- День 2: трансфекции клеток с Sf9 флуоресцентно меткой PKCS использованием Cellfectin II трансфекции реагента. Мы часто совместно выразили в этой системе PKCS с меткой расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) и мономерного красного флуоресцентного белка (mRFP) (детали для плазмиды строительство было описано выше 2,5). Выражение одного флуоресцентного белка в то время, дает около 70-80% клеток, экспрессирующих 72 часов после трансфекции. Сотрудничество выражение из двух флуоресцентных белков снижает эффективность трансфекции примерно до 30% со-экспрессирующие клетки. Когда совместно выражения EGFP с метками РКС и mRFP с метками РКС, используйте 2 раза больше плазмидной ДНК для mRFP с метками белка для оптимальной экспрессии белка.
- Живой концерт-визуализация 48-72 часов после трансфекции (для оптимальной экспрессии белка, подождите 72 часа).
3. Выражение флуоресцентно меткой PKCS в Aplysia сенсорных нейронов
- Подготовка Aplysia нейронных культурах клеток было описано в статье видео Чжао и его коллеги 4.
- PKCS помеченные флуоресцентными белками выражаются в Aplysia сенсорных нейронов использованием микроинъекции процедуры подробно описаны ниже.
- Подготовка исходного раствора 1% Быстрый зеленый (FCF) в дистиллированной воде, фильтр, используя шприц и 28 мм шприц фильтр (0,20 мкм). Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
- Микроинъекции сенсорных нейронов может быть выполнена в день 1 или 2-й день после изоляции нейронов, но мы находим, что ожидание 2 дня позволяет лучше клетка соблюдение покровное.
- На 2-й день после выделения сенсорных нейронов, оттепель аликвоту Быстрый зеленый и отфильтровать его снова с помощью шприца и 28 мм шприц фильтр (0,20 мкм).
- Приготовьте раствор плазмидной ДНК в дистиллированной воде, содержащей 0,5% Быстрый Грин. Концентрации ДНК плазмиды достигает 0,4 мкг / мкл можно использовать, но это не рекомендуется, чтобы пойти выше этих значений.
- Фильтры ДНК плазмиды / Быстро Зеленые решения с использованием 1 мл шприц и 4 мм, шприц фильтр (0,20 мкм).
- Центрифуга ДНК плазмиды / Быстро Зеленый раствор при 16 110 мкг в течение 15 минут с помощью микрофонаrocentrifuge.
- Подготовка резкое электродов для микроинъекции нейронов использованием микроэлектрода съемник (Саттер Flaming / коричневый микропипетки Puller, модель P-97). Использование окна нити, вытащить стекло микроэлектродов с 1 мм наружный диаметр, 0,75 мм в диаметре и длиной 100 мм с использованием тонких стен стеклянных капилляров с нитью внутри (Всемирный точных приборов TW100F-4). Дополнительные сведения о потянув микроинъекции электродов пожалуйста, обратитесь к Саттер поваренная книга электрода.
- Заполните каждый электрод с 2 мкл ДНК плазмиды / Быстро Зеленые решения с использованием microloader пипетки (Eppendorf CA32950-050).
- Передача нижней Маттек стекла культуры блюдо с Aplysia нейронных культур микроинъекции станции.
- Микроинъекции Станция состоит из следующих действий: самодельная большой сцене стекла провести культуры блюда на стол виброизоляции (Kinetic вибрации Системы изоляции рабочей станции), стерео-рамки с наружного освещения галогенные, микроманипулятора (Саттер Хаксли настенного типа микроманипулятора которая позволяет не только грубые и ультра-точного позиционирования в трех-ось), микроэлектрода держатель подключен к пневматического насоса (инструменты Всемирного Precision PV820 пневматический Pico-насоса). Ввод давления пневматического насоса подключен к бак сжатым азотом.
- Вставьте микроэлектрод в микроэлектрода держателя.
- Просмотр в стерео-микроскопом, вставьте кончик микропипетки в клеточном ядре.
- Доставить коротких импульсов давления азота (от 10 до 100 мс в срок; 20 фунт / 2), пока ядро становится uniformely зеленый.
- Инкубируйте клетки в течение 4 часов при комнатной температуре и хранить при температуре 4 ° С до использования. Для оптимального PKC транслокации, выступать с концертами-изображений эксперимента 20 - 24 часов после инъекции.
4. Визуализация PKC транслокации в живых Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов
- Для обработки изображений, мы используем Zeiss LSM510 перевернутой конфокальной микроскопии с Axiovert 200.
- Изображений протокол является одинаковым для Sf9 клеток и для Aplysia сенсорных нейронов, за исключением следующих: Sf9 клетки, полученную с использованием x63 цель погружения в то время как нефть Aplysia сенсорных нейронов, полученную с целью погружения нефть x40. Sf9 клетки отображается в контролируемой температурой камере поддерживается на уровне 26-27 ° С, тогда как Aplysia сенсорных нейронов изображаются при комнатной температуре поддерживается около 18-20 ° С.
- Мы используем 30 мВт аргонового лазера (возбуждение при 488nm) с 50% излучения лазера на изображение РКС с меткой EGFP белка и лазерной HeNe (возбуждение при 543nm), чтобы изображение РКС с меткой белка mRFP. Аргон и гелий-неоновый лазер линии ослабляются до 4% и 50% передачи результатов соответственно до визуализации и отверстие настраивается на один.
- Важно, чтобы культура блюдо стабилизировались на этапе визуализации и избежать движение или вибрацию.
- Удалить 1 мл культуральной среды от блюдо аккуратно использованием 10 мл пипетки оставляя 1 мл общего объема в блюдо.
- Снимайте в средней части клетки, где ядра можно увидеть.
- Настройка временных рядов 10-20 конфокальных изображений съемки каждые 30 секунд.
- Начало временных рядов.
- После 2-х снимков (после 30 секунд момент времени), добавьте 1 мл препарата (2 раза концентрации) мягко капельный в верхней части клетки, используя P1000 пипетки. Препарат добавил непрерывно в течение приблизительно 30 секунд.
- Некоторые препараты вызывают быстрое перемещение которых могут быть видны сразу после медикаментозного лечения (на 60 пунктов время секунд), а другие вызывают медленное перемещение которых только оптимальные 5-10 минут после лечения (Фильм 1 и Фильм 2).
- Если препарат необходимо смыть с помощью 2 х 10 мл пипец сделать мыть, пипетки промывочный буфер мягко с одной пипетки с одной стороны от тарелки и pipeting до средств массовой информации, с другой стороны.
- Если мыть была эффективной, и если эффект препарата является обратимым, РКС возвращается к цитозоля в течение 30-60 секунд.
- Сохранить фильм как LSM файл.
- Используйте NIH Image J программного обеспечения, чтобы открыть файлы LSM и количественно изображения до и после лечения препаратом. Количественное была описана в другом месте 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали технику изображения транслокации флуоресцентно меткой PKCS в реальном времени в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов. Sf9 клетки обеспечивают простую систему, чтобы изображение PKC транслокации с культивированием и трансфекции их довольно просто. В противоположность этому, микроинъекции Aplysia сенсорных нейронов требуется некоторое время на освоение, до нескольких месяцев. Трудности, связанные с этой техникой включают электрод засорения. Фильтрация раствора для инъекций и центрифугирования это обычно помогает, но иногда пузырьки воздуха могут образовываться в электроде при заполнении его. Мы находим, что с помощью microloader наконечники пополнить электрода вместо капиллярности помогает свести к минимуму образование воздушных пузырьков. Что касается живого изображения, два фактора должны быть под жестким контролем в течение сессии изображений: температура и движение. Температурные колебания могут повлиять на перемещение и использование контролируемой температурой камеры должны быть рассмотрены. Для того чтобы избежать движения во время съемки, стол виброизоляции могут быть использованы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке канадских институтов здравоохранения (CIHR) Грант Wayne S. Sossin. Кэрол А. Фарах является обладателем докторской стипендий, начиная с де-ла-Fonds Recherche ан Santé Квебека (FRSQ) и Конрад Харрингтон общения. Авторы хотели бы поблагодарить Джоанна Бужи, Маргарет Гастингс и Маргарет Лаббан за помощь снимать видео и Мадлен Ричмонд бассейна за помощь в графическом обзоре.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Use to make micr–lectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Micr–lectrode holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Use to hold micr–lectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Use to position micr–lectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
