Summary
في هذا الفيديو ، ونظهر تصور إزفاء PKC في الخلايا الحية باستخدام PKCS الموسومة fluorescently.
Abstract
بروتين كيناز جيم (PKCS) هي السيرين ثريونين كاينيسات التي تلعب دورا مركزيا في تنظيم مجموعة واسعة من العمليات الخلوية مثل نمو الخلايا والتعلم والذاكرة. هناك أربع عائلات معروفة من الأشكال الإسوية PKC في الفقاريات : PKCS الكلاسيكية (α ، βI ، وβII γ) ، اكتب رواية أنا PKCS (ε η و) ، رواية من النوع الثاني PKCS (δ وθ) ، وPKCS شاذة (وι ζ ). يتم تنشيط PKCS الكلاسيكية كا 2 + وdiacylclycerol (DAG) ، في حين يتم تنشيط PKCS رواية همرشولد ، ولكن كا 2 + مستقلة. يتم تنشيط PKCS شاذة التي لا كا 2 + ولا همرشولد. في californica Aplysia ، لدينا نظام نموذجي لدراسة تكوين الذاكرة ، وهناك ثلاثة نظام محدد العصبي الأشكال الإسوية PKC واحد من كل فئة رئيسية ، هي التقليدية PKC APL انا ، انا اكتب رواية PKC APL الثاني والثالث شاذة PKC الألغام المضادة للأفراد. PKCS والدهون تنشيط كاينيسات ، وبالتالي فقد تم تفعيل PKCS الرواية الكلاسيكية واستجابة لإشارات خارج الخلية مرتبطة بشكل متكرر مع إزفاء PKC من السيتوبلازم إلى غشاء البلازما. ولذلك ، تصور إزفاء PKC في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية قد أصبحت أداة لا تقدر بثمن لتوضيح مسارات نقل الإشارة التي تؤدي إلى تفعيل PKC. على سبيل المثال ، سمحت هذه التقنية بالنسبة لنا لإثبات أن الأشكال الإسوية المختلفة من PKC نقل من مكان لآخر في ظل ظروف مختلفة للتوسط أنواع متميزة من اللدونة متشابك وأن السيروتونين (5HT) تفعيل PKC APL الثاني يتطلب إنتاج كل من حمض الفسفاتيديك همرشولد و(السلطة الفلسطينية) من أجل إزفاء 1-2. الأهم ، والقدرة على تصور الخلية العصبية نفسها مرارا وتكرارا وقد سمح لنا ، على سبيل المثال ، لقياس الحساسية للاستجابة PKC بالتفصيل رائعة 3. في هذا الفيديو ، ونظهر كل خطوة من إعداد الثقافات الخلية Sf9 ، وقد وصفت الثقافات من الخلايا العصبية الحسية Aplysia في مقال آخر فيديو 4 ، معربا عن PKCS الموسومة fluorescently Sf9 في الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية والعيش التصوير من إزفاء PKC ردا على تفعيل مختلفة باستخدام الليزر المجهر.
Protocol
1. إعداد وصيانة Sf9 الثقافات المونولاير الخليوي
- يتم تنفيذ Sf9 خلية ثقافة والصيانة في نسيج الثقافة هود.
- وتستمد Sf9 خلايا من خلايا المبيض Spodoptera frugiperda (Sf21 الخلايا) ويمكن شراؤها على شكل خلايا مجمدة في وسائل الإعلام من Invitrogen غريس.
- 8 مل من مكان المتوسطة غريس الحشرات ، على أن تستكمل (1X) ، والتي 30 ٪ الجنين مصل الأبقار (FBS) وقد أضيف في 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة مع رقبة ميال.
- ذوبان الجليد أنبوب المجمدة للSf9 الخلايا بسرعة في حمام مائي 37 ° C بتحريك الأنبوب ذهابا وإيابا (حوالي 1-2 دقائق).
- Sf9 نقل الخلايا إلى 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة والصفيحة الصخرية بلطف باليد لتوزيع الخلايا بالتساوي.
- احتضان 1-2 ساعات حتى 27 درجة مئوية حتى الخلايا قد المرفقة.
- إزالة المتوسطة القديمة واستبدالها مع 10 مل من الحشرات والمتوسطة freshGrace FBS مع 30 ٪.
- احتضان حتى 27 درجة مئوية حتى الخلايا متموجة.
- للحفاظ على الثقافات أحادي الطبقة ، وإزالة المتوسطة من العمر القارورة متموجة من Sf9 الخلايا وإضافة 5 مل من المتوسط غريس الحشرات مع FBS 10 ٪.
- بخفة على جانب القارورة عدة مرات لفصل Sf9 الخلايا.
- باستخدام ماصة 10 مل وpipettor أ ، ماصة وسائل الإعلام بلطف صعودا وهبوطا مرة واحدة ، في حين الرش جدار القارورة pipetting أسفل. نقل الخلايا إلى أنبوب العقيمة Polysterene 15 مليلتر.
- إضافة 2 مل من تعليق خلية Sf9 إلى 8 مل من المتوسط غريس الحشرات مع FBS 10 ٪ (1:5 تخفيف للحفاظ على سجل النمو المرحلة) في 75 سم 2 جديدة الخلية قارورة الثقافة والصفيحة الصخرية بلطف باليد.
- احتضان حتى 27 درجة مئوية حتى الخلايا متموجة.
2. التعبير عن الكلمات الدلالية PKCS Fluorescently في خلايا Sf9
- ليعيش تجربة التصوير ، والثقافة Sf9 الخلايا على الزجاج 35 ملم ماتيك disheswith ثقافة أسفل سطح الزجاج من 14 ملم وسماكة ساترة من 0،16-0،19 مم.
- وأعرب PKCS المفتاحية مع البروتينات الفلورية في Sf9 الخلايا باستخدام كاشف Cellfectin ترنسفكأيشن الثاني التوصية التالية من الشركة المصنعة مع التعديلات المفصلة أدناه.
- اليوم 1 : قبل طلاء الخلايا ، وعلاج كل طبق ماتيك المتوسطة مع غريس الحشرات مع FBS 10 ٪ على الأقل 30 دقيقة.
- العد Sf9 الخلايا من الخطوة 11 (أعلاه) باستخدام عدادة الكريات.
- لوحة 0.05 × 10 6 خلايا في كل ساترة ماتيك الزجاج في حجم ما مجموعه 150 ميكرولتر. السماح للخلايا تعلق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 2 مل من وتستكمل مع غريس FBS 10 ٪ لكل 1 مل طبق في وقت ببطء لتجنب فصل الخلايا.
- احتضان حتى 27 درجة مئوية خلال الليل.
- من هذه النقطة ، واستخدام توصية الشركة المصنعة لترنسفكأيشن Sf9 من خلايا الحمض النووي مع البلازميد.
- يوم 2 : Transfect Sf9 الخلايا مع PKCS الموسومة fluorescently باستخدام كاشف Cellfectin ترنسفكأيشن الثاني. نحن غالبا ما يكون التعاون وأعرب في هذا النظام PKCS المفتاحية البروتين المعزز نيون الخضراء (eGFP) والبروتين موحودي نيون الأحمر (mRFP) (التفاصيل لبناء البلازميد وقد وصفت سابقا 2،5). التعبير عن بروتين واحد في وقت واحد الفلورسنت غلة حوالي 70-80 ٪ معربا عن خلايا في مرحلة ما بعد 72 ساعة ترنسفكأيشن. شارك في التعبير عن اثنين من البروتينات الفلورية انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن إلى حوالي 30 ٪ شارك في التعبير عن الخلايا. عندما شاركت في التعبير عن eGFP الموسومة PKC وmRFP الموسومة PKC ، استخدم 2X DNA البلازميد لمزيد من البروتين mRFP الموسومة للتعبير البروتين الأمثل.
- أداء حية التصوير 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الأمثل للتعبير البروتين ، والانتظار 72 ساعة).
3. التعبير عن الكلمات الدلالية PKCS Fluorescently في الخلايا العصبية الحسية Aplysia
- وقد وصفت إعداد الثقافات Aplysia الخلية العصبية في مادة الفيديو و 4 تشاو الزملاء.
- وأعرب PKCS المفتاحية مع البروتينات الفلورية في الخلايا العصبية الحسية Aplysia باستخدام الإجراء microinjection المفصلة أدناه.
- يعد حل سريع الأسهم الخضراء 1 ٪ (FCF) في الماء المقطر ، والتصفية باستخدام حقنة وحقنة 28 ملم تصفية (0.20 ميكرون). قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- لا يمكن أن يؤديها Microinjection من الخلايا العصبية الحسية في يوم 1 أو 2 بعد يوم وعزل الخلايا العصبية لكننا نجد أن الانتظار 2 أيام يسمح للانضمام إلى خلية أفضل ساترة.
- يوم 2 بعد عزل الخلايا العصبية الحسية ، وأذاب an قسامة الخضراء سريعة وتصفية مرة أخرى باستخدام حقنة وحقنة تصفية 28 ملم (0.20 ميكرون).
- يعد حل DNA البلازميد في الماء المقطر الخضراء التي تحتوي على السريع 0.5 ٪. ويمكن استخدام تركيزات DNA البلازميد تصل إلى 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر ولكن ليس من المستحسن أن يذهب فوق هذه القيم.
- تصفية DNA البلازميد / حل سريع الخضراء باستخدام حقنة 1 مل 4 مم والمحاقن تصفية (0.20 ميكرون).
- أجهزة الطرد المركزي ال DNA البلازميد / حل سريع الخضراء في XG 16110 لمدة 15 دقيقة باستخدام الميكروفونrocentrifuge.
- إعداد الأقطاب حادة لmicroinjection من الخلايا العصبية باستخدام مجتذب microelectrode (سوتر يلهب / براون Micropipette بولير ، الموديل P - 97). باستخدام خيوط مربع ، وسحب microelectrodes الزجاج مع القطر الخارجي 1 مم ، 0.75 مم داخل القطر وطول 100 مم باستخدام رقيقة الجدار الزجاجي الشعيرات الدموية مع خيوط داخل (البنك الآلات الدقيقة TW100F - 4). لمزيد من المعلومات حول سحب أقطاب microinjection يرجى الرجوع إلى كتاب طبخ كهربائي سوتر.
- ملء كل قطب كهربائي مع 2 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد / حل سريع الخضراء باستخدام ماصة microloader غيض (إيبندورف CA32950 - 050).
- نقل أسفل الزجاج ماتيك صحن يحتوي على ثقافة الثقافات Aplysia العصبية إلى محطة microinjection.
- محطة microinjection يتكون من التالي : منزل من صنع الزجاج كبيرة المرحلة لعقد الأطباق الثقافة على طاولة الاهتزاز العزلة (الحركية العزلة اهتزاز نظم محطة العمل) ، وستيريو النطاق مع إضاءة الهالوجين الخارجية ، micromanipulator ألف (سوتر نوع ستريت هكسلي Micromanipulator والذي يسمح لتحديد المواقع على حد سواء الخشنة وفائق النعومة في المحور الثالث) ، حامل microelectrode متصلة مضخة هوائية (الآلات الدقيقة العالم PV820 - مضخة هوائية بيكو). توصيل الإدخال ضغط المضخة الهوائية إلى خزان نيتروجين مضغوط.
- إدراج microelectrode في حامل microelectrode.
- عرض تحت المجهر ستيريو ، إدراج غيض من micropipette في نواة الخلية.
- توصيل نبضات قصيرة من ضغط النيتروجين (10 إلى 100 مللي ثانية في المدة ، و 20 رطل / في 2) حتى تصبح نواة uniformely الخضراء.
- احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. لإزفاء PKC الأمثل ، وتنفيذ التجربة الحية التصوير 20-24 ساعة بعد الحقن.
4. تصور الحياة في إزفاء PKC Sf9 الخلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia
- التصوير ، ونستخدم LSM510 زايس مجهر مقلوب مبائر مع 200 Axiovert.
- التصوير البروتوكول هو نفسه لSf9 الخلايا العصبية والحسية Aplysia باستثناء ما يلي : يتم تصوير Sf9 الخلايا مع هدف النفط الغمر x63 بينما تصوير الخلايا العصبية الحسية Aplysia مع الغمر X40 الهدف النفط. يتم تصوير Sf9 الخلايا في غرفة التحكم في درجة حرارته درجة مئوية في الحفاظ على 26-27 في حين أن تصوير الخلايا العصبية الحسية Aplysia المحافظة على درجة حرارة الغرفة حوالي 18-20 درجة مئوية.
- نحن نستخدم 30 ميغاواط الأرجون ليزر (الإثارة في 488nm) مع انتاج 50 ٪ ليزر PKC صورة المفتاحية مع بروتين eGFP والليزر HeNe (الإثارة في 543nm) لPKC صورة المفتاحية mRFP البروتين. والأرجون وخطوط HeNe الليزر هي الموهن إلى 4 ٪ ، ويتم ضبط 50 ٪ على التوالي قبل الانتقال الإخراج إلى التصوير والثقب وإلى واحد.
- فمن المهم أن يكون الطبق الثقافة استقرت على المسرح والتصوير وتجنب الحركة أو اهتزاز.
- إزالة 1 مل من وسائل الإعلام الثقافة من صحن به برفق ماصة 10 مل ترك 1 مل حجم الكلي في الطبق.
- التقاط صور في الجزء الأوسط من الخلايا التي يمكن أن ينظر إلى النواة.
- إعداد سلسلة زمنية من 10-20 مبائر الصور التقاط صورة كل 30 ثانية.
- تبدأ السلسلة الزمنية.
- بعد أخذ الصور 2 (بعد الساعة 30 نقطة ثانية) ، إضافة 1 مل من المخدرات (2X تركيز) بلطف الانقطاع عن الإفلات من قبل في أعلى الخلايا باستخدام ماصة P1000. يضاف الدواء باستمرار لمدة 30 ثانية تقريبا.
- بعض الأدوية إحداث إزفاء السريعة التي يمكن أن تكون مرئية مباشرة بعد العلاج من تعاطي المخدرات (60 نقطة في الوقت ثانية) في حين أن آخرين إحداث إزفاء البطيء ، والذي يبعد دقائق فقط 50-10 بعد العلاج الأمثل (1 و الفيلم السينمائي 2).
- إذا كان هذا الدواء يجب أن جرفت ، واستخدام 2 × 10 مل pipets للقيام يغسل ، pipetting المخزن يغسل برفق مع أحد ماصة على جانب واحد من صحن وpipeting حتى وسائل الإعلام على الجانب الآخر.
- إذا كان قد تم غسل فعالة وإذا كان تأثير الدواء هو عكسها ، PKC يعود إلى العصارة الخلوية داخل 30-60 ثانية.
- حفظ الفيلم كملف LSM.
- استخدام البرمجيات NIH J صورة لفتح ملفات LSM وتحديد الصور قبل وبعد العلاج من تعاطي المخدرات. وقد وصفت في مكان آخر الكمي 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصفت لدينا التقنية لإزفاء صورة PKCS fluorescently المفتاحية في الوقت الحقيقي في Sf9 الخلايا والخلايا العصبية في Aplysia الحسية. Sf9 الخلايا توفير نظام بسيط لإزفاء صورة PKC منذ زراعة وtransfecting لهم هي جميلة على التوالي إلى الأمام. في المقابل ، microinjection من الخلايا العصبية الحسية Aplysia يستغرق بعض الوقت لاتقان ؛ تصل إلى بضعة أشهر. صعوبات تتعلق هذه التقنية تشمل انسداد الكهربائي. تصفية الحل الحقن والطرد المركزي ولكن عادة أنها تساعد فقاعات الهواء في بعض الأحيان يمكن أن تشكل في القطب في حين شغل عنه. نجد أن استخدام ماصة نصائح microloader لتملأ الكهربائي بدلا من الشعرية يساعد على التقليل من تشكيل فقاعات الهواء. فيما يعيش التصوير ، واثنين من العوامل تحتاج إلى رقابة مشددة خلال دورة التصوير : درجة الحرارة والحركة. قد تؤثر التقلبات في درجات الحرارة إزفاء وينبغي النظر في استخدام غرفة التحكم في درجة حرارته. لتجنب الحركة أثناء التصوير ، ويمكن استخدام جدول عزل الاهتزاز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لمنح الصحة (CIHR) بحوث لاين S. Sossin. كارول ألف فرح وهو حاصل على زمالة ما بعد الدكتوراه من فون بحوث دي لا سانتي ان كيبيك (FRSQ) وزمالة هارينجتون كونراد. فإن الكتاب أود أن أشكر جوانا بوجي ، مارغريت هاستينغز واللبان مارغريت للمساعدة في تبادل لاطلاق النار الفيديو ومادلين ريتشموند حمام سباحة للحصول على مساعدة مع نظرة عامة على الرسم.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Use to make micr–lectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Micr–lectrode holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Use to hold micr–lectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Use to position micr–lectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
