Summary
在这段视频中，我们证明在使用PKCS荧光标记的活细胞PKC移位可视化。
Abstract
蛋白激酶CS（PKCS）丝氨酸苏氨酸激酶，发挥核心作用，在规范的多种细胞过程，如细胞的生长和学习记忆。有四种已知脊椎动物中的PKC亚型的家庭：古典PKCS（α，βI，βII和γ），新颖的I型PKCS（ε，η），小说II型PKCS（δ和θ），非典型PKCS（ζ和ι ）。古典PKCS被激活的Ca 2 +和diacylclycerol（DAG），而小说PKCS是由DAG的激活，但独立的Ca 2 +。既不钙2 +和 DAG的非典型PKCS被激活。在海兔californica，我们的模型系统来研究记忆的形成，有三个中枢神经系统特定PKC亚型从每个主要类别之一，即传统的PKC的美国总统轮船我的小说类型我PKC的美国总统轮船II和非典型PKC的美国总统轮船三。 PKCS脂激活蛋白激酶和外信号激活古典与新颖的PKCS已经经常与PKC从胞浆易位到质膜相关。因此，在活细胞中实时蛋白激酶C移位可视化已成为一个宝贵的工具，阐明导致PKC激活的信号转导通路。例如，这项技术已允许我们建立不同的PKC亚型转运不同条件下的调解不同类型的突触可塑性和激活PKC的美国总统轮船II，5 - 羟色胺（5HT）需要DAG和磷脂酸（PA）的生产易位1-2。更重要的是，相同的神经元的能力，可视化多次允许我们，例如，在精致的细节 3 PKC反应来衡量的脱敏。在这个视频中，我们展示了准备的Sf9细胞培养的每一步，海兔感觉神经元的文化已在另一视频第4条所述，表示在Sf9 细胞，并在海兔感觉神经元和PKC的易位的生活成像PKCS荧光标记反应不同的活化剂，使用激光扫描显微镜。
Protocol
1。昆虫细胞单层培养的制备及保养
- 在组织培养罩的Sf9细胞培养和维护。
- Sf9细胞来源于草地夜蛾卵巢细胞（Sf21细胞），可作为冷冻细胞购自Invitrogen Grace的媒体。
- 广场8毫升Grace的昆虫培养基（1X），其中30％小牛血清（FBS），已在一个倾斜的脖子75 厘米2细胞培养瓶中加入。
- 在37℃水浴融化Sf9细胞冷冻管迅速来回移动管（约1-2分钟）。
- Sf9细胞转移到75厘米的2细胞培养瓶和岩石板，用手轻轻地均匀地分发细胞。
- 孵育1-2小时在27℃直至细胞附着。
- 删除旧的介质，含30％FBS和10毫升freshGrace的昆虫媒介取代。
- 孵育27℃直至细胞融合。
- 为了保持单层培养，Sf9细胞融合烧瓶中删除旧培养基，加入含10％胎牛血清的Grace的昆虫媒介的5毫升。
- 烧瓶的侧轻轻敲击几次分离Sf9细胞。
- 使用10 mL的吸管和一个移液器，移液器媒体一次轻轻的向上和向下，喷洒烧瓶壁吹打下来。将细胞15毫升无菌Polysterene管。
- Grace的昆虫媒介的8毫升与10％FBS（1:5稀释维持数期增长）在新的75厘米 2细胞培养瓶和岩石板手轻轻的Sf9细胞悬液，加入2毫升。
- 孵育27℃直至细胞融合。
2。 PKCS荧光标记在Sf9细胞中的表达
- 对于实时成像实验，文化的Sf9细胞上的35毫米MatTek玻璃底部文化disheswith一个14毫米，盖玻片厚度为0.16至0.19毫米的玻璃表面。
- PKCS荧光蛋白标记的表达的Sf9细胞，利用Cellfectin II转染试剂在下面详细的修改制造商的以下建议。
- 第1天：电镀细胞之前，对待每个MatTek菜Grace的昆虫媒介为至少30分钟，含10％胎牛血清。
- Sf9细胞计数从第11步使用hemacytometer（以上）。
- 板0.05 × 10 6细胞上的每一个总体积150μLMatTek玻璃盖玻片。允许细胞附着在室温下30分钟。
- 加入2毫升Grace的补充慢慢地在同一时间，以避免细胞分离到每道菜1毫升含10％胎牛血清。
- 孵育27℃过夜。
- 从这点上，利用昆虫细胞与质粒DNA转染的制造商的建议。
- 第2天：转染的Sf9细胞与荧光标记的使用PKCS Cellfectin二转染试剂。我们经常合作与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和单体红色荧光蛋白（MRFP）（先前已经描述2,5质粒的构建的细节）标签系统PKCS表示。一次在一个荧光蛋白的表达产量约70-80％，表达细胞转染后72小时。两个荧光蛋白的共表达减少约30％，共同表达细胞转染效率。当共同表达EGFP标记的蛋白激酶C和MRFP标签的蛋白激酶C，使用最佳的蛋白表达MRFP标签蛋白的2倍更多的质粒DNA。
- 现场演奏成像48-72小时后转染（最佳蛋白的表达，等待72小时）。
3。 海兔感觉神经元中表达的荧光标记的PKCS
- 海兔的神经元细胞培养制备已在视频文章赵和他的同事4。
- PKCS荧光蛋白标记的表达在海兔感觉神经元，用显微注射过程的详细。
- 准备在蒸馏水中的1％快绿（FCF）原液，过滤器使用注射器和一个28毫米的注射器过滤器（0.20微米）。分装并储存于-20 ° C
- 微量注射的感觉神经元可进行1天或2天，后分离的神经元，但我们发现，等待2天，可以更好的细胞黏附盖玻片。
- 第2天，感觉神经元的隔离后，解冻快速绿色等分，并再次使用的注射器和注射器过滤器的28毫米（0.20微米）过滤。
- 准备在蒸馏水中的质粒DNA溶液中含有0.5％的快速绿色。可用于高0.4μg/μL的质粒DNA的浓度，但它是不建议去以上这些价值观。
- 过滤用1 ml注射器和4毫米的注射器过滤器（0.20微米）的质粒DNA /快速绿色解决方案。
- 离心15分钟用一个麦克风的质粒DNA在16110 XG /快速的绿色解决方案rocentrifuge。
- 准备使用电极拉马的神经元显微注射（萨特火焰山/布朗微管拖轮，P - 97型）电极是雪亮的。使用一箱长丝，拉1毫米外径，内径0.75毫米和100毫米的长度内丝（世界精密仪器TW100F - 4）采用薄壁玻璃毛细管玻璃微电极。对于拉动显微注射电极的更多信息，请参阅萨特电极食谱
- 填写每个电极与2μL质粒DNA /使用microloader枪头（Eppendorf公司CA32950 - 050），快速的绿色解决方案。
- 转让MatTek玻璃底培养皿中含有海兔的神经元文化，以显微注射站。
- 显微注射站包括以下内容：一个自制的大玻璃舞台举行振动隔离表（动力学系统隔振工作站），与外部的卤素灯照明的立体范围，显微（萨特赫胥黎墙型微操作机器人的培养皿它允许在三个轴粗，超细定位），一个电极连接到气动泵（世界精密仪器的Pico - PV820气动泵）的持有人。气动泵的压力输入连接到一个压缩的氮气罐。
- 一个微电极插入微电极支架。
- 一个立体显微镜下观看，插入到细胞核内的微尖。
- 提供短期的氮压力脉冲（持续时间10至100毫秒，20磅/英寸2），直到原子核变得uniformely绿色。
- 4小时在室温下孵育细胞，并保持在4℃，直到使用。为了达到最佳的PKC易位，执行生活成像实验20 - 24小时后注射。
4。可视化在生活Sf9细胞，并在海兔感觉神经元PKC的易位
- 成像，我们使用的Zeiss LSM510倒置共聚焦显微镜与AXIOVERT 200。
- Sf9细胞和海兔感觉神经元以下除外：Sf9细胞与x63油浸物镜成像，而海兔感觉神经元与X40油浸物镜成像成像协议。 Sf9细胞成像维持在26-27 摄氏度的温度控制腔， 而海兔感觉神经元是在室温保持18-20摄氏度左右成像
- 我们用一个30兆瓦的氩激光（488nm激发）50％的激光输出图像与EGFP蛋白激酶C和一个氦氖激光（543nm激发）MRFP蛋白标记的图像的PKC标签。氩和氦氖激光线衰减到4％，和50％的传输输出分别成像和针孔前调整到一个。
- 重要的是有稳定成像舞台上的培养皿，以避免运动或振动。
- 删除从盘留在菜总量的1毫升10毫升吸管轻轻使用1毫升培养基。
- 在细胞的细胞核中可以看出中间部分图片。
- 设置了10-20共聚焦图像，拍摄一张照片，每30秒的时间序列。
- 启动时间序列。
- 2张照片（后30秒的时间点）后，添加1毫升的药物（2X浓度）的使用P1000的吸管细胞之上轻轻落降。该药物是不断增加约30秒。
- 有些药物诱导快速移位，可立即显示下列药物治疗（在60秒的时间点），而其他诱发一个缓慢的易位，这是唯一的最佳治疗后（1电影和电影2）5-10分钟。
- 如果药物需要被冲走，使用2 × 10 mL的吸管做洗，上下吹打洗涤缓冲液，轻轻一个吸管的菜一边和对方pipeting媒体。
- 如果洗一直有效，如果该药物的影响是可逆的的，蛋白激酶C在30-60秒内将恢复到细胞质。
- 作为LSM文件保存的电影。
- 美国国立卫生研究院使用Image J软件打开LSM的文件和量化的图像前和后的药物治疗。定量已在别处1。
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Discussion
我们已经描述了一种技术，实时图像PKCS荧光标记的易位在Sf9细胞， 并在海兔感觉神经元。 Sf9细胞提供了一个简单的系统形象PKC的易位，因为培养和转染他们是相当平直向前。相比之下，微量注射海兔感觉神经元需要一些时间来掌握，最多几个月。有关这项技术的困难，包括电极堵塞。过滤注射液和离心它通常会帮助，但有时气泡在电极形成却使。我们发现，使用microloader枪头填补电极代替毛细作用，有助于最大限度地减少气泡的形成。关于活成像，两个因素需要成像会议期间要严格控制温度和运动。温度波动可能会影响易位，并应考虑使用一个温度控制厅。要避免在成像运动，振动隔离表都可以使用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持由加拿大卫生研究所（CIHR）批准机构韦恩南Sossin。阿玲A.法拉是从全宗德拉RECHERCHE EN桑特魁北克（FRSQ）和康拉德哈灵顿奖学金博士后奖学金获得者。作者想感谢乔安娜探条，玛格丽特黑斯廷斯和玛格丽特Labban与视频拍摄和图形概述帮助马德琳里士满池帮助。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Use to make micr–lectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Micr–lectrode holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Use to hold micr–lectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Use to position micr–lectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
