Summary

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Published: April 06, 2011
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Summary

In diesem Video zeigen wir, Visualisierung von PKC-Translokation in lebenden Zellen mit fluoreszenzmarkierten PKCs.

Abstract

Protein-Kinase-Cs (PKCS) sind Serin-Threonin-Kinasen, die eine zentrale Rolle spielen bei der Regulation einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Zellwachstum und Lernen und Gedächtnis. Es gibt vier bekannte Familien von PKC-Isoformen bei Wirbeltieren: klassische PKCs (α, ßi, βII und γ), Roman Typ I PKCs (ε und η), neuartige II PKCs (δ und θ) und atypische PKC (ζ und ι ). Die klassische PKCs werden durch Ca 2 + aktiviert und diacylclycerol (DAG), während der Roman PKCs durch DAG aktiviert werden, sondern sind Ca 2 +-unabhängig. Die atypische PKC sind weder durch Ca 2 + noch DAG aktiviert. In Aplysia californica, unser Modellsystem zur Gedächtnisbildung Studie, gibt es drei Nervensystem spezifischen PKC-Isoformen einer aus jeder großen Klasse, nämlich der konventionellen PKC Apl I, die neue Typ-I-PKC Apl II und der atypischen PKC Apl III. PKCS Lipid-Kinasen aktiviert und damit die Aktivierung der klassischen und neuen PKC als Reaktion auf extrazelluläre Signale wurde häufig mit PKC-Translokation aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran korreliert. Daher hat die Visualisierung PKC-Translokation in Echtzeit in lebenden Zellen werden ein unschätzbares Werkzeug für die Aufklärung der Signalwege, die PKC-Aktivierung führen. Zum Beispiel hat diese Technik für uns erlaubt festzustellen, dass verschiedene Isoformen der PKC unter verschiedenen Bedingungen translozieren, um verschiedene Arten von synaptischer Plastizität vermitteln und dass Serotonin (5HT) Aktivierung von PKC Apl II erfordert die Herstellung der beiden DAG und Phosphatidsäure (PA) für Translokation 1-2. Wichtig ist, dass die Fähigkeit, die gleichen Neuron visualisieren wiederholt hat uns erlaubt, zum Beispiel zu einer Desensibilisierung der PKC Reaktion in exquisite detail 3 zu messen. In diesem Video haben wir jeden Schritt der Herstellung Sf9-Zellkulturen zu demonstrieren, haben Kulturen der Aplysia sensorischen Neuronen in einem anderen Video Artikel 4 beschrieben worden sind, zum Ausdruck fluoreszenzmarkierten PKCs in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen und Live-Darstellung von PKC-Translokation in Reaktion auf verschiedene Aktivatoren mittels Laser-Scanning-Mikroskopie.

Protocol

1. Erstellung und Pflege von Sf9-Monolayer Kulturen Sf9-Zellkultur und Wartung in einer Gewebekultur Abzug durchgeführt. Sf9-Zellen werden aus Spodoptera frugiperda Eierstock-Zellen (Sf21 Zellen) abgeleitet und kann als eingefrorene Zellen in Grace Medien von Invitrogen erworben werden. Platz 8 ml Insektenmedium Grace, ergänzt (1X), zu dem 30% fötales Rinderserum (FBS) hat in einer 75 cm 2 Zellkulturflasche mit einer verkantet Hals aufgenommen worden. Aufta…

Discussion

Wir haben eine Technik zur Bild Translokation von fluoreszenzmarkierten PKCs beschrieben in Echtzeit in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen. Sf9-Zellen bieten ein einfaches System, um Bild PKC-Translokation seit Kultivierung und Transfektion von ihnen ist ziemlich geradlinig. Im Gegensatz dazu nimmt die Mikroinjektion von Aplysia sensorischen Neuronen einiger Zeit zu meistern, bis zu einigen Monaten. Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dieser Technik gehören Elektrode verstopfen. Filterung…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Grant zu Wayne S. Sossin unterstützt. Carole A. Farah ist der Empfänger ein Postdoc-Stipendium aus dem Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und Conrad Harrington Gemeinschaft. Die Autoren bedanken sich bei Joanna Bougie, Margaret Hastings und Margaret Labban für die Hilfe bei der Video-Dreh und Madeline Richmond Pool für die Hilfe bei der grafischen Übersicht danken.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sf9 frozen cells Spodoptera frugiperda ovarian cells Invitrogen B825-01  
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid Reagent Gibco 11605-094 Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask Tool Corning 430720 Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum Reagent CanSera CS-C08-500 Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe Tool Becton Dickinson 309604 Use to filter Fast Green solution
Syringe Tool Becton Dickinson 309602 Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter Tool Corning 431229 Use to filter Fast Green solution
Filter Tool Corning 431212 Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish Tool Mattek P35G-1.5-14-C Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent Reagent Invitrogen 10362-100 Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF Reagent Sigma-Aldrich F-7252 Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries Tool World Precision Instruments TW100F-4 Use to make microelectrodes for microinjection
Microloader pipette tip Tool Eppendorf CA32950-050 Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump Tool World Precision Instruments SYS-PV820 Part of microinjection station
Microelectrode holder Tool World Precision Instruments MPH6S Use to hold microelectrode
Micromanipulator Tool Sutter MP-85 Use to position microelectrode in the three-axis

References

  1. Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
  2. Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
  3. Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
  4. Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
  5. Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).

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Cite This Article
Farah, C. A., Sossin, W. S. Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2516, doi:10.3791/2516 (2011).

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