Summary

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Published: April 06, 2011
doi:

Summary

בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.

Abstract

חלבון קינאז Cs (PKCS) הם סרין קינאזות תראונין כי תפקיד מרכזי בוויסות מגוון רחב של תהליכים תאיים כגון צמיחת תאים למידה וזיכרון. ישנן ארבע משפחות הידועים של isoforms PKC בבעלי חוליות: PKCS קלאסית (α, βI, βII ו γ), סוג הרומן אני PKCS (ε ו η), רומן מסוג II PKCS (δ ו θ), ו PKCS טיפוסיות (ζ ו ι ). PKCS קלאסית מופעלים על ידי Ca 2 + ו diacylclycerol (דאג), בעוד PKCS רומן מופעלים על ידי DAG, אבל הם Ca 2 + עצמאית. PKCS טיפוסיות מופעלים על ידי לא Ca 2 + וגם לא דאג. ב Aplysia californica, מערכת המודל שלנו ללמוד היווצרות הזיכרון, ישנם שלושה ספציפיים מערכת העצבים isoforms PKC אחד מתוך כל שיעור גדול, כלומר קונבנציונלי PKC Apl אני, סוג הרומן אני PKC Apl השנייה טיפוסיות PKC Apl III. PKCS הם שומנים בדם מופעל קינאזות ובכך ההפעלה של PKCS קלאסית רומן בתגובה לאותות תאיים כבר בקורלציה לעתים קרובות עם טרנסלוקציה PKC מן הציטופלסמה אל קרום התא. לכן, טרנסלוקציה PKC חזותי בזמן אמת בתאים חיים הפך להיות כלי רב ערך עבור הבהרת הולכת אותות מסלולים שיובילו הפעלת PKC. לדוגמה, טכניקה זו אפשרה לנו לקבוע כי isoforms שונים של PKC translocate בתנאים שונים לתווך סוגים שונים של הפלסטיות הסינפטית וכי (5HT) סרוטונין הפעלת PKC Apl השנייה דורשת ייצור של שני DAG ו phosphatidic חומצה (רש"פ) עבור טרנסלוקציה 1-2. חשוב לציין, את היכולת לדמיין את אותו הדבר שוב ושוב נוירון אפשרה לנו, למשל, כדי למדוד את הפחתת רגישות התגובה PKC בפירוט מעולה 3. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת Sf9 תרביות תאים, תרביות של נוירונים Aplysia חושית תוארו במאמר אחר וידאו 4, להביע PKCS מתויג fluorescently ב Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי לחיות הדמיה טרנסלוקציה של PKC בתגובה activators שונים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית.

Protocol

1. הכנה ותחזוקה של Sf9 תרבויות monolayer Cell Sf9 תרבית תאים והתחזוקה מתבצעת במנדף בתרבית רקמה. Sf9 תאים מתאי Spodoptera frugiperda השחלות (Sf21 תאים) וכן ניתן לרכוש תאים קפואים התקשורת של גרייס מן Invitrogen. <li st…

Discussion

תיארנו טכניקה הדימוי של טרנסלוקציה PKCS מתויג fluorescently בזמן אמת Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושית. Sf9 תאים לספק מערכת פשוטה טרנסלוקציה תמונה PKC מאז culturing ו transfecting אותם הוא די ישר קדימה. לעומת זאת, microinjection של נוירונים Aplysia חושית לוקח קצת זמן כדי לשלוט; עד כמה חודשים. קשיי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקנדי הלאומי לבריאות מחקר (CIHR) מענק ויין ס Sossin. קרול א פרח הוא מקבל המלגה הבתר מן Fonds de la משוכלל ונדיר en סנטה קוויבק (FRSQ) וכן הרינגטון קונרד המילגה. המחברים מבקשים להודות ג'ואנה פתילון, מרגרט הייסטינגס מרגרט Labban לעזרה עם לירות וידאו בריכת מדליין ריצ'מונד לעזרה עם סקירה הגרפיקה.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sf9 frozen cells Spodoptera frugiperda ovarian cells Invitrogen B825-01  
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid Reagent Gibco 11605-094 Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask Tool Corning 430720 Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum Reagent CanSera CS-C08-500 Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe Tool Becton Dickinson 309604 Use to filter Fast Green solution
Syringe Tool Becton Dickinson 309602 Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter Tool Corning 431229 Use to filter Fast Green solution
Filter Tool Corning 431212 Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish Tool Mattek P35G-1.5-14-C Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent Reagent Invitrogen 10362-100 Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF Reagent Sigma-Aldrich F-7252 Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries Tool World Precision Instruments TW100F-4 Use to make microelectrodes for microinjection
Microloader pipette tip Tool Eppendorf CA32950-050 Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump Tool World Precision Instruments SYS-PV820 Part of microinjection station
Microelectrode holder Tool World Precision Instruments MPH6S Use to hold microelectrode
Micromanipulator Tool Sutter MP-85 Use to position microelectrode in the three-axis

References

  1. Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
  2. Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
  3. Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
  4. Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
  5. Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).

Play Video

Cite This Article
Farah, C. A., Sossin, W. S. Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2516, doi:10.3791/2516 (2011).

View Video