Summary
इस वीडियो में, हम रहने वाले fluorescently टैग PKCS का उपयोग कर कक्षों में PKC स्थानान्तरण के दृश्य प्रदर्शित करता है.
Abstract
प्रोटीन kinase Cs (PKCS) threonine kinases है कि सेल के विकास और सीखने और स्मृति के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता को विनियमित करने में एक केंद्रीय भूमिका निभा सेरीन हैं. PKC isoforms की रीढ़ में चार ज्ञात परिवारों हैं: शास्त्रीय PKCS (α, βI, βII और γ), उपन्यास प्रकार मैं PKCS (ε और η), उपन्यास प्रकार द्वितीय पीकेसीएस (δ और θ), और atypical (PKCS ζ और ι ). शास्त्रीय PKCS Ca 2 द्वारा सक्रिय कर रहे हैं + और (DAG) diacylclycerol, जबकि उपन्यास PKCS DAG द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, लेकिन 2 Ca + स्वतंत्र हैं . atypical PKCS न तो + न ही DAG 2 Ca द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. Aplysia californica में, हमारे मॉडल प्रणाली स्मृति गठन का अध्ययन, वहाँ तीन तंत्रिका तंत्र विशिष्ट PKC प्रत्येक प्रमुख वर्ग से isoforms, अर्थात् पारंपरिक PKC एपीएल मैं, उपन्यास प्रकार मैं PKC एपीएल द्वितीय और atypical PKC एपीएल III हैं . PKCS kinases लिपिड सक्रिय हैं और इस प्रकार कोशिकी संकेतों के जवाब में शास्त्रीय और उपन्यास PKCS के सक्रियण अक्सर cytoplasm से प्लाज्मा झिल्ली PKC स्थानान्तरण के साथ सहसंबद्ध किया गया है. इसलिए, जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में PKC स्थानान्तरण visualizing संकेत पारगमन मार्ग है कि PKC सक्रियण के लिए नेतृत्व elucidating के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है. उदाहरण के लिए, इस तकनीक के लिए हमें की अनुमति दी गई है स्थापित करने के लिए है कि PKC के अलग isoforms अलग अलग परिस्थितियों में टसकाना synaptic plasticity के विशिष्ट प्रकार मध्यस्थता और PKC एपीएल द्वितीय की है कि serotonin सक्रियण (5HT) के लिए दोनों DAG और phosphatidic एसिड (PA) के उत्पादन की आवश्यकता है 1-2 स्थानान्तरण. महत्वपूर्ण बात, एक न्यूरॉन ही कल्पना करने की क्षमता को बार - बार हमें, उदाहरण के लिए, उत्तम विस्तार में 3 PKC प्रतिक्रिया की desensitization को मापने के लिए अनुमति दी गई है. इस वीडियो में, हम Sf9 सेल संस्कृतियों की तैयारी के हर कदम का प्रदर्शन, एक और वीडियो 4 लेख में Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स की संस्कृतियों में वर्णित किया गया है, के जवाब में Sf9 कोशिकाओं में और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स और PKC स्थानान्तरण के रहते इमेजिंग में fluorescently टैग PKCS व्यक्त अलग लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग activators.
Protocol
1. तैयारी और Sf9 सेल monolayer संस्कृतियों का रखरखाव
- Sf9 सेल संस्कृति और रखरखाव एक टिशू कल्चर हुड में किया जाता है.
- Sf9 कोशिकाओं Spodoptera frugiperda डिम्बग्रंथि कोशिकाओं (Sf21 सेल) से व्युत्पन्न हैं और Invitrogen से अनुग्रह मीडिया में जमे हुए कोशिकाओं के रूप में खरीदा जा सकता है .
- प्लेस अनुग्रह कीट मध्यम, पूरक (1X), जो 30% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) एक 75 सेमी एक canted गर्दन के साथ 2 सेल संस्कृति कुप्पी में जोड़ा गया है. के 8 एमएल
- Sf9 कोशिकाओं के जमे हुए ट्यूब तेजी ट्यूब आगे और पीछे जाने (बारे में 1-2 मिनट) द्वारा एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पहले गला लें.
- 75 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क और रॉक थाली Sf9 कोशिकाओं धीरे हाथ से कोशिकाओं को समान रूप से वितरित स्थानांतरण .
- 27 में 1-2 घंटे सेते डिग्री सेल्सियस जब तक कोशिकाओं संलग्न है.
- पुराने मध्यम निकालें और 30% FBS के साथ freshGrace कीट मध्यम के 10 एमएल के साथ की जगह.
- सेते 27 डिग्री सेल्सियस जब तक कोशिकाओं मिला हुआ हैं.
- Monolayer संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए, Sf9 कोशिकाओं के मिला हुआ कुप्पी से पुराने मध्यम हटाने और अनुग्रह कीट मध्यम के 10% FBS के साथ 5 एमएल जोड़ने.
- हल्के कुप्पी की तरफ कई बार Sf9 कोशिकाओं को अलग नल.
- एक 10 एमएल विंदुक और एक pipettor का प्रयोग, विंदुक ऊपर और नीचे एक बार धीरे मीडिया, जबकि नीचे pipetting फ्लास्क दीवार छिड़काव. एक बाँझ 15 एमएल Polysterene ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण.
- 10% (01:05 करने के लिए लॉग चरण के विकास को बनाए रखने के लिए कमजोर पड़ने) के नए 75 2 सेमी सेल संस्कृति फ्लास्क और रॉक थाली में हाथ से धीरे FBS के साथ अनुग्रह कीट मध्यम 8 एमएल Sf9 सेल निलंबन की 2 एमएल जोड़ें.
- सेते 27 डिग्री सेल्सियस जब तक कोशिकाओं मिला हुआ हैं.
2. Fluorescently टैग PKCS Sf9 कक्ष में अभिव्यक्ति
- के लिए रहते इमेजिंग प्रयोग, संस्कृति Sf9 35 मिमी MatTek गिलास नीचे संस्कृति disheswith 14 मिमी और 0,16 से 0,19 मिमी की एक coverslip मोटाई का एक गिलास सतह पर कोशिकाओं.
- फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग PKCS Sf9 अभिकर्मक निम्नलिखित सिफारिश Cellfectin द्वितीय नीचे विस्तृत संशोधनों के साथ निर्माता के अभिकर्मक का उपयोग कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं.
- दिन 1: पूर्व कोशिकाओं चढ़ाना के लिए अनुग्रह कम से कम 30 मिनट के लिए 10% FBS के साथ कीट मध्यम के साथ प्रत्येक MatTek पकवान का इलाज.
- 11 कदम (ऊपर) एक hemacytometer का उपयोग से Sf9 कोशिकाओं की गणना.
- 0.05 प्लेट x 150 μL की कुल मात्रा में प्रत्येक MatTek कांच coverslip पर 6 10 कोशिकाओं. कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति दें.
- 2 के एमएल ग्रेस 10% FBS के साथ धीरे धीरे समय detaching कोशिकाओं से बचने के प्रत्येक पकवान 1 एमएल के लिए पूरक जोड़ें.
- 27 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
- इस बिंदु पर, प्लास्मिड डीएनए के साथ Sf9 कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए निर्माता की सिफारिश का उपयोग करें.
- दिन 2: transfect fluorescently टैग PKCS Cellfectin द्वितीय अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर के साथ Sf9 कोशिकाओं. हम अक्सर इस प्रणाली PKCS बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) और monomeric लाल प्रतिदीप्त (mRFP) प्रोटीन (प्लाज्मिड निर्माण के विवरण के लिए पहले 2,5 वर्णित किया गया है) के साथ टैग में सह व्यक्त . एक समय में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के बारे में 70-80% की कोशिकाओं व्यक्त 72 घंटे बाद अभिकर्मक पैदावार. दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन की सह - अभिव्यक्ति के बारे में 30% सह व्यक्त कोशिकाओं अभिकर्मक दक्षता कम हो जाती है. जब EGFP टैग PKC और mRFP टैग PKC सह व्यक्त mRFP टैग इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रोटीन के लिए अधिक डीएनए प्लाज्मिड 2x का उपयोग करें.
- प्रदर्शन इमेजिंग रहते 48-72 घंटे के बाद अभिकर्मक (इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, 72 घंटे प्रतीक्षा).
3. Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स में fluorescently टैग PKCS की अभिव्यक्ति
- Aplysia neuronal सेल संस्कृतियों की तैयारी Zhao और सहयोगियों 4 द्वारा एक वीडियो लेख में वर्णित किया गया है.
- फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग PKCS Aplysia संवेदी microinjection नीचे विस्तृत प्रक्रिया का उपयोग न्यूरॉन्स में व्यक्त कर रहे हैं .
- आसुत जल में 1% फास्ट ग्रीन (FCF) के एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए, एक सिरिंज और एक 28 मिमी सिरिंज फिल्टर (0.20 सुक्ष्ममापी) का उपयोग कर फ़िल्टर. विभाज्य और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान
- संवेदी न्यूरॉन्स की Microinjection न्यूरॉन्स अलग करने के बाद 1 दिन या 2 दिन पर प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन हमें लगता है कि 2 दिन प्रतीक्षा बेहतर सेल coverslip के लिए पालन के लिए अनुमति देता है.
- 2 दिन संवेदी न्यूरॉन्स के अलगाव के बाद, फास्ट ग्रीन के एक विभाज्य पिघलना और इसे फिर से फिल्टर एक सिरिंज और एक 28 मिमी सिरिंज फिल्टर (0.20 सुक्ष्ममापी) का उपयोग.
- आसुत जल में प्लास्मिड डीएनए के एक समाधान तैयार युक्त 0.5% फास्ट ग्रीन. प्लाज्मिड डीएनए के रूप में 0.4 के रूप में μg / μL उच्च सांद्रता लेकिन इस्तेमाल किया जा सकता है और यह इन मूल्यों के ऊपर जाने के लिए अनुशंसित नहीं है.
- प्लास्मिड डीएनए / फास्ट ग्रीन समाधान 1 एमएल सिरिंज और एक 4 मिमी सिरिंज फिल्टर (0.20 सुक्ष्ममापी) का उपयोग कर फ़िल्टर.
- 15 मिनट के लिए एक mic का उपयोग प्लाज्मिड / 16110 XG पर फास्ट ग्रीन समाधान डीएनए अपकेंद्रित्रrocentrifuge.
- तेज इलेक्ट्रोड microelectrode खींचने का उपयोग न्यूरॉन्स की microinjection (ज्वलंत Sutter / ब्राउन micropipette डांड़ी, मॉडल P-97) के लिए तैयार करें. एक बॉक्स फिलामेंट का प्रयोग, 1 मिमी बाहरी व्यास, व्यास के अंदर 0.75 मिमी और 100 मिमी लंबाई अंदर एक रेशा (विश्व परिशुद्धता उपकरण TW100F-4) के साथ पतली दीवार गिलास capillaries का उपयोग के साथ कांच microelectrodes खींच. Microinjection इलेक्ट्रोड खींच के बारे में अधिक जानकारी के लिए कृपया Sutter इलेक्ट्रोड रसोई की किताब के लिए देखें.
- प्लास्मिड डीएनए / फास्ट ग्रीन समाधान microloader विंदुक टिप (Eppendorf CA32950-050) का उपयोग कर के 2 μL प्रत्येक इलेक्ट्रोड के साथ भरें.
- MatTek गिलास नीचे संस्कृति microinjection स्टेशन Aplysia neuronal संस्कृतियों वाले पकवान स्थानांतरण.
- microinjection स्टेशन निम्न में से होते हैं: एक घर बनाया बड़े कांच चरण के लिए एक कंपन अलगाव तालिका (काइनेटिक सिस्टम कंपन अलगाव वर्कस्टेशन), बाहरी हलोजन रोशनी के साथ एक स्टीरियो - गुंजाइश, एक micromanipulator (Sutter हक्सले दीवार प्रकार micromanipulator पर संस्कृति बर्तन पकड़ जो तीन अक्ष में दोनों मोटे और अल्ट्रा ठीक स्थिति की अनुमति देता है), एक microelectrode धारक एक साँस पंप (विश्व प्रेसिजन उपकरण PV820 वायवीय पिको - पम्प) से जुड़े. वायवीय पंप के दबाव इनपुट एक संकुचित नाइट्रोजन टैंक से जुड़ा है.
- Microelectrode धारक में एक microelectrode डालें.
- एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत देखना, सेल नाभिक में micropipette की नोक सम्मिलित.
- नाइट्रोजन के कम दबाव दालों उद्धार (अवधि में 10 से 100 एमएस, 20 / 2 पौंड) में जब तक नाभिक uniformely हरा हो जाता है.
- कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक 4 में रखना. 24 घंटे बाद इंजेक्शन - इष्टतम PKC स्थानान्तरण के लिए, जीने इमेजिंग 20 प्रयोग प्रदर्शन.
4. PKC स्थानान्तरण Sf9 कक्ष जहाँ रहते हैं और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स में विज़ुअलाइज़ेशन
- इमेजिंग के लिए, हम एक Axiovert 200 के साथ एक Zeiss LSM510 उल्टे confocal खुर्दबीन का उपयोग करें.
- Sf9 कोशिकाओं को एक x63 तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ imaged हैं जबकि Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स एक X40 तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ imaged हैं: इमेजिंग प्रोटोकॉल निम्नलिखित के लिए छोड़कर Sf9 कोशिकाओं के लिए और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स के लिए ही है. Sf9 कोशिकाओं को एक तापमान नियंत्रित 26-27 ओ सी में रखा कक्ष में imaged जबकि Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स कमरे में 18-20 ओ सी के आसपास के तापमान पर बनाए रखा imaged
- हम 50% लेजर उत्पादन के साथ एक 30 मेगावाट आर्गन लेजर (488nm पर उत्तेजना) छवि EGFP प्रोटीन और HeNe छवि mRFP प्रोटीन के साथ टैग PKC के लिए लेजर (543nm पर उत्तेजना) के साथ टैग PKC उपयोग करने के लिए. आर्गन और HeNe लेजर लाइनों 4% तनु हैं और 50% संचरण क्रमशः इमेजिंग और pinhole से पहले उत्पादन को समायोजित है.
- यह संस्कृति इमेजिंग मंच पर स्थिर पकवान और आंदोलन या कंपन से बचने के महत्वपूर्ण है.
- धीरे से एक 10 एमएल डिश में 1 एमएल कुल मात्रा छोड़ने पिपेट का उपयोग पकवान से संस्कृति मीडिया के 1 एमएल निकालें.
- जहां नाभिक देखा जा सकता है कोशिकाओं के मध्य भाग में तस्वीरें ले लो.
- 10-20 confocal छवियों के एक तस्वीर लेने के हर 30 सेकंड एक समय श्रृंखला सेट.
- समय की श्रृंखला शुरू करो.
- 2 चित्रों के बाद लिया जाता है (30 सेकंड समय बिंदु के बाद), दवा के 1 एमएल (2X एकाग्रता) धीरे P1000 विंदुक का उपयोग कोशिकाओं के शीर्ष पर ड्रॉप द्वारा ड्रॉप जोड़ें. दवा के बारे में 30 सेकंड के लिए लगातार जुड़ जाता है.
- कुछ दवाओं एक तेजी से स्थानान्तरण जो दिखाई तुरंत निम्न दवा इलाज किया जा सकता है (60 सेकंड समय बिंदु पर), जबकि दूसरों को एक धीमी गति स्थानान्तरण जो केवल इष्टतम 5-10 मिनट के इलाज के बाद (1 मूवी और 2 मूवी) प्रेरित प्रेरित.
- यदि दवा धुल की जरूरत है, का उपयोग करने के लिए 2 एक्स 10 एमएल pipets धोने, धोने बफर धीरे नीचे एक विंदुक के साथ पकवान की एक तरफ pipetting और दूसरी तरफ मीडिया pipeting.
- यदि धोने प्रभावी किया गया है और अगर दवा के प्रभाव पलटवाँ है, PKC cytosol 30-60 सेकंड के भीतर वापस reverts.
- एक LSM फ़ाइल के रूप में फिल्म सहेजें.
- LSM फ़ाइलों को खोलने के लिए और छवियों प्री और पोस्ट नशीली दवाओं के उपचार यों एनआईएच छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. मात्रा का ठहराव 1 कहीं वर्णित किया गया है.
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Discussion
हम fluorescently टैग PKCS की छवि स्थानान्तरण करने के लिए एक तकनीक का वर्णन है Sf9 कोशिकाओं में और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स में वास्तविक समय में. Sf9 कोशिकाओं छवि PKC स्थानान्तरण करने के लिए एक सरल प्रणाली प्रदान करते हैं क्योंकि संवर्धन और उन्हें transfecting सुंदर सीधे आगे है. इसके विपरीत, Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स की microinjection कुछ समय के लिए मास्टर लेता है, एक कुछ महीने के लिए. इस तकनीक से संबंधित कठिनाइयाँ इलेक्ट्रोड clogging शामिल हैं. इंजेक्शन समाधान छनन और यह centrifuging आम तौर पर मदद करता है, लेकिन कभी कभी हवा के बुलबुले इलेक्ट्रोड में फार्म जबकि यह भरने कर सकते हैं. हम पाते हैं कि microloader विंदुक युक्तियाँ का उपयोग करने के लिए कपिलैरिटि के बजाय इलेक्ट्रोड को भरने के लिए हवाई बुलबुले के गठन को कम करने में मदद करता है. जीना इमेजिंग के बारे में, दो कारकों को कसकर इमेजिंग सत्र के दौरान नियंत्रित किया जा जरूरत है: तापमान और आंदोलन. तापमान उतार चढ़ाव स्थानान्तरण प्रभावित और तापमान नियंत्रित एक कक्ष का उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए सकता है. इमेजिंग के दौरान आंदोलन से बचने के लिए, एक कंपन अलगाव तालिका इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान (CIHR) की वेन एस Sossin के लिए संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. कैरोल ए फराह डे ला Fonds Recherche एन SANTE डु (FRSQ) क्यूबेक और कॉनरोड Harrington फैलोशिप से एक postdoctoral फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है. लेखकों वीडियो और ग्राफिक सिंहावलोकन के साथ मदद के लिए मेडलिन रिचमंड पूल शूट के साथ मदद के लिए Joanna बत्ती, मार्गरेट हेस्टिंग्स और मार्गरेट Labban धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Use to make micr–lectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Micr–lectrode holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Use to hold micr–lectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Use to position micr–lectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
