Summary
このビデオでは、我々は、蛍光標識のPKCS使用して生きた細胞内PKC転座の可視化を実証する。
Abstract
プロテインキナーゼCS（PKCには）そのような細胞の成長と学習と記憶のような細胞プロセスの様々な調節において中心的役割を果たすスレオニンキナーゼセリンです。古典的PKCに（α、βI、βII、γ）、新規のI型は、PKCS（ε、η）、小説II型PKCの（δ、θ）、そして非定型PKCの（ζとι：脊椎動物におけるPKCアイソフォームの4つの既知の家族が暮らしている）。古典的なPKCSは、 カルシウムによって活性化されている小説のPKCがDAGにより活性化されるが、Ca 2 +の -独立している間に+とdiacylclycerol（DAG）、。非定型PKCには、Ca 2 +もDAGのどちらによって活性化されています。 アメフラシカリフォルニ 、記憶形成を研究する我々のモデルシステムでは、という三神経系特異的PKCアイソフォームの主要な各クラスから1つ、従来のPKC APL私、小説のI型PKC APL IIと非定型PKC APL IIIがあります。 PKCには、脂質活性化キナーゼであるため、細胞外シグナルに応答して、古典と小説PKCの活性化は、しばしば細胞質から形質膜へのPKC転座と相関している。そのため、生きた細胞でリアルタイムでPKCトランスロケーションを可視化するPKCの活性化につながるシグナル伝達経路を解明するための貴重なツールとなっています。私たちはシナプス可塑性の異なる型を媒介するため、異なる条件下で転位するPKCの、異なるアイソフォームを確立し、PKC APL IIの、セロトニン（5HT）アクティベーションのためのDAGとホスファチジン酸の両方の生産（PA）を必要とするために例えば、このテクニックは、許可されている転座1-2。重要なのは、同じニューロンを可視化する機能は、繰り返し私たちは、例えば、絶妙の詳細3におけるPKC応答の脱感作を測定することができました。このビデオでは、我々はSf9細胞培養の準備の各ステップを示す、 アメフラシ感覚ニューロンの培養物に反応してSf9細胞やアメフラシ感覚神経とPKC転座のライブイメージングの蛍光標識のPKCS発現する別のビデオの第4条に記載されているレーザー走査顕微鏡を用いて異なる活性剤。
Protocol
1。 Sf9細胞の単層培養の準備とメンテナンス
- Sf9細胞の培養と維持管理は、組織培養フードで実行されます。
- Sf9細胞はスポドプテラフルギペルダの卵巣細胞（Sf21細胞）から誘導されるとインビトロジェンからグレースのメディアで凍結した細胞として購入することができます。
- 補ったグレイス昆虫培地、（1X）、〜30％ウシ胎児血清（FBS）斜め首が75 cm 2の細胞培養フラスコ内で追加された。の代わりに8 mLの
- （約1〜2分）前後にチューブを移動して37℃のウォーターバス中で急速にSf9細胞の凍結チューブを融解する。
- 均等に細胞を分散さは75 cm 2の細胞培養フラスコと優しく手で岩の板にSf9細胞を移す。
- 細胞が接続されるまで、27で1〜2時間℃でインキュベートする。
- 古い培地を除去し、30％FBSをfreshGraceの昆虫培地10mLに置き換えます。
- 細胞がコンフルエントになるまで27℃でインキュベートする。
- 単層培養を維持するためには、Sf9細胞のコンフルエントなフラスコから古い培地を除去し、10％FBSをグレース昆虫培地5 mLを加える。
- 軽くフラスコの側にSf9細胞を分離するために数回タップします。
- ピペッティングしながらフラスコの壁を噴霧、一度ゆっくりと上下に10 mLのピペットとピペッター、ピペットメディアを使用する。滅菌済み15 mLのPolystereneチューブに細胞を移す。
- 新しい75センチメートル2細胞培養フラスコと優しく手で岩の板に10％FBS（対数増殖期を維持するために1:5希釈）とグレース昆虫培地を8mLにSf9細胞懸濁液2 mlを加え。
- 細胞がコンフルエントになるまで27℃でインキュベートする。
2。 Sf9細胞で蛍光標識PKCの発現
- ライブイメージングの実験、文化35ミリメートルでSf9細胞マテックガラス底培養disheswith 14mmのガラス表面と0.16〜0.19ミリメートルのカバーガラスの厚さ。
- 蛍光タンパク質でタグ付けされたPKCSは、以下に詳述する変更とメーカーのCellfectin IIのトランスフェクション試薬、以下の推奨事項を使用したSf9細胞で発現されています。
- 1日目：前に細胞を播種するために、少なくとも30分間、10％FBSとグレース昆虫培地で各マテックの料理を扱う。
- 血球計を使用して、ステップ11（上記）からSf9細胞を数える。
- 150μLの全体積の各マテックのガラスカバースリップ上にプレートを0.05 × 10 6個の細胞。細胞は室温で30分間添付することができます。
- グレースの2mLを徐々に細胞を脱着しないように、各皿を1 mLに10％FBSを添加している追加。
- 27℃で一晩。
- この時点から、プラスミドDNAをSf9細胞のトランスフェクションのための製造業者の勧告を使用してください。
- 2日目：Cellfectin IIのトランスフェクション試薬を用いて蛍光標識およびPKCSトランスフェSf9細胞。私たちはしばしば、このシステムで共発現している（プラスミド構築のための詳細は以前に2,5を記載されている）強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）と単量体の赤色蛍光タンパク質（MRFP）でタグ付けされたPKCS。一度に蛍光タンパク質の発現は約70〜80％の細胞に発現している72時間のトランスフェクション後に得られます。つの蛍光タンパク質の同時発現は、約30％共発現細胞にトランスフェクション効率を低下させる。 PKC EGFP -タグ付きおよびPKC MRFP -タグを共発現したとき、最適なタンパク質発現のためのMRFP -タグ融合タンパク質のためのより多くのプラスミドDNAを2倍使用してください。
- 実行ライブイメージング48〜72時間トランスフェクション後（最適なタンパク質発現のために、72時間を待つ）。
3。 アメフラシ感覚ニューロンに蛍光標識PKCの発現
- アメフラシ神経細胞培養の調製は、趙と同僚の4でビデオの記事に記載されている。
- 蛍光タンパク質でタグ付けされたPKCSは、以下に詳述するマイクロインジェクションの手順を使用してアメフラシ感覚ニューロンに発現されています。
- 蒸留水の1％ファストグリーン（FCF）のストック溶液を調製、注射器と28ミリメートルシリンジフィルター（0.20μm）を使用してフィルタ。 -20℃で分注しストア
- 感覚ニューロンのマイクロインジェクションは、神経細胞を分離した後、1日または2日目に行ったが、我々は2日待っていると、カバースリップに優れた細胞接着を可能にすることに気付くことができます。
- 感覚ニューロンの単離後2日目に、ファストグリーンのアリコートを解凍し、注射器と28ミリメートルシリンジフィルター（0.20μm）を使用して再度フィルタ。
- 0.5パーセントファストグリーンを含む蒸留水でプラスミドDNAの溶液を調製します。 μg/μLの0.4という高いプラスミドDNAの濃度を使用することができますが、これらの値より上にすることは推奨されません。
- 1 mLの注射器と4mmシリンジフィルター（0.20μm）を用いてプラスミドDNA /ファストグリーンソリューションをフィルタリングします。
- マイクを使って15分間16110 × gでプラスミドDNA /ファストグリーンソリューションを遠心rocentrifuge。
- 微小電極プラーを使用して神経細胞のマイクロインジェクション（サッターフレイミング/ブラウンマイクロピペットプラー、モデルP - 97）のために鋭い電極を準備します。ボックスのフィラメントを使用して、1ミリメートル、外径、内径0.75ミリメートルと内部のフィラメント（世界精密機器がTW100F - 4）で薄壁ガラスキャピラリーを用いて長さ100 mmのガラス微小電極を引き出します。マイクロインジェクションの電極を引き出す方法の詳細についてはサター電極の料理本を参照してください。
- microloaderピペットチップ（エッペンドルフCA32950 - 050）を用いてプラスミドDNA /ファストグリーン溶液2μLを各電極を埋める。
- マイクロインジェクションの駅にアメフラシ神経細胞の培養を含むマテックガラス底の培養皿に移す。
- マイクロインジェクションステーションの構成は次のとおりです。自家製の防振台（キネティックシステムの防振ワークステーション）、外部のハロゲン照明とステレオスコープ、マイクロマニピュレーター（サターハクスリーウォールタイプのマニピュレーターに培養皿を保持するために、大きなガラスのステージをその空気ポンプ（世界の精密機器PV820空気圧ピコ-ポンプ）に接続されている微小電極ホルダー、）三軸の粗と超微細位置決めの両方を可能にする。空気ポンプの圧力入力は、圧縮された窒素のタンクに接続されています。
- 微小電極ホルダーに微小電極を挿入します。
- ステレオ顕微鏡下での表示、細胞核内にマイクロピペットの先端を挿入します。
- 核がuniformely緑色になるまで、窒素（/ 2の20ポンド期間に10〜100ミリ秒）の短い圧力パルスを実現。
- 室温で4時間細胞をインキュベートし、℃で使用するまで4℃で保管。 24時間後に注射 - 最適なPKC転座の場合は、ライブイメージングの実験20を実行してください。
4。 Sf9細胞をリビングにし、 アメフラシ感覚ニューロンにおけるPKC転座の可視化
- イメージングのために、我々は、Axiovert 200でツァイスLSM510倒立型共焦点顕微鏡を使用してください。
- イメージングプロトコルは、次の点以外はSf9細胞用とアメフラシ感覚神経でも同じです： アメフラシ感覚ニューロンは、X40の油浸対物レンズで撮像されているのに対し、Sf9細胞は、X63油浸対物レンズで撮像されています。 Sf9細胞は、 アメフラシ感覚ニューロンが18から20 o Cで台を維持室温でイメージングされたのに対し、26〜27 ° Cの時に維持温度制御チャンバー内に撮像されています
- 我々は、EGFPタンパク質とMRFPタンパク質でタグ付けされた画像のPKCにHeNeレーザー（543nmで励起）でタグ付けされた画像のPKCに50％のレーザー出力で30mWのアルゴンレーザー（488nmの励起）を使用します。アルゴンやヘリウムネオンレーザーの線は4％に減衰しており、事前の画像処理やピンホールにはそれぞれ50％の伝送出力が1に調整されます。
- イメージング段階で安定培養皿を持っているし、動きや振動を避けることが重要です。
- 静かに皿に1 mLの全容量を残して10 mLのピペットを用いてディッシュから培地を1mLを削除します。
- 核を見ることができる細胞の中央部で撮影してください。
- 画像は30秒ごとに取る10月20日共焦点画像の時系列を設定します。
- 時系列を開始します。
- 写真2枚が（30秒の時点の後に）撮影された後、軽く薬を1 mL（2X濃度）P1000ピペットを用いて細胞の上にドロップしてドロップを追加。薬剤は、約30秒間連続して追加されます。
- 一部の薬は、他の人が唯一の最適な5〜10分後の治療（動画1と動画2）である遅い転座を誘発しながら（60秒の時点で）すぐに次の薬物治療に表示できる高速な転座を誘発する。
- 薬剤が洗い流さする必要がある場合は、皿の片側に1つのピペットで静かに洗浄バッファーをピペッティングし、反対側でメディアをペッティング、洗浄を行うために2 × 10 mLのピペットを使用してください。
- 洗浄が効果的と薬剤の効果は可逆的であるかにされている場合、PKCは30〜60秒以内に細胞質ゾルに戻ります。
- LSMファイルとしてムービーを保存します。
- LSMのファイルを開くと画像が前と後の薬物治療定量化するためにNIHの画像Jソフトウェアを使用してください。定量化は別の場所で1記載されている。
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Discussion
我々は、Sf9細胞やアメフラシ感覚ニューロンのリアルタイムで蛍光標識PKCの画像の転座に手法を記載している。 Sf9細胞は、培養するため、画像PKC転座にシンプルなシステムを提供し、それらをトランスフェクトするのはとても簡単です。対照的に、 アメフラシ感覚ニューロンのマイクロインジェクションは、習得には時間がかかります。まで数カ月に。この技法に関連する問題は、電極の目詰まりなどがあります。注射液をフィルタリングし、それを遠心分離すると、通常のに役立ちますが、それをいっぱいにしながら時々気泡が電極に形成することができます。我々は、代わりに毛細管現象の電極を埋めるためにmicroloaderピペットチップを使用すると、気泡の形成を最小限に抑えるために役立つことがわかります。温度と運動：ライブイメージングについては、二つの要因は、しっかりとイメージングのセッション中に制御する必要があります。温度の変動は、転座に影響を与える可能性がありますし、温度制御チャンバーの使用を考慮する必要があります。撮影時の動きを避けるために、防振テーブルを使用することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ウェインS. Sossinに健康研究（CIHR）グラントのカナダの協会によってサポートされていました。キャロルA.ファラーはデラフォンルシェルシュエンサンテケベック（FRSQ）とコンラッドハリントンの交わりからポスドクの受信者です。著者は、グラフィックの概要とヘルプのためのビデオ撮影とマデリーンリッチモンドプールのヘルプはジョアンナブジー、マーガレットヘイスティングスとマーガレットLabbanに感謝します。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | BD Biosciences | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | Use to make micr–lectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments, Inc. | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Micr–lectrode holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH6S | Use to hold micr–lectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter Instrument Co. | MP-85 | Use to position micr–lectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &, Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &, Klein, M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &, Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
