이 비디오에서는, 우리는 찬란 태그 PKCS을 사용하여 살아있는 세포에서 PKC translocation의 시각화를 보여줍니다.
Abstract
단백질 키나제 고사 (PKCS)는 같은 세포 성장과 학습과 메모리로 휴대 프로세스의 다양한 규제에 중심 역할을 트레오닌 kinases 세린입니다. 척추 동물에서 PKC isoforms 네 가지 알려진 가족이 있습니다 : 고전 PKCS (α, βI, βII 및 γ), 소설 형식 내가 PKCS (ε와 η), 소설 유형 II PKCS (δ와 θ) 및 비정형 PKCS (ζ 및 ι ). 고전 PKCS는 칼슘이 활성화하는 소설 PKCS는 가리비 활성화하지만, 칼슘 2 + – 독립하는 동안 +와 diacylclycerol (가리비). 비정형 PKCS는 +이나 가리비 칼슘이도에 의해 활성화됩니다. Aplysia californica에서는, 메모리 형성을 공부하기 위해 모델 시스템, 즉 세 신경계 특정 PKC isoforms 각 주요 클래스에서 하나 기존의 PKC APL I, 소설 종류 I PKC APL II 및 비정형 PKC APL III있다. PKCS는 지질 활성화 kinases되며 따라서 세포 신호에 대한 응답으로 고전과 소설 PKCS의 활성화가 자주 세포질에서 플라즈마 막에 PKC translocation와 상관되었습니다. 따라서, 라이브 세포에서 실시간으로 PKC translocation을 시각화하는 것은 PKC 활성화로 이어질 신호 전달 경로를 elucidating위한 소중한 도구가되고있다. 예를 들어,이 기술은 PKC의 다른 isoforms은 시냅스 소성의 독특한 유형을 중재하기 위해 서로 다른 조건에서 이동시키다 및 PKC APL II의 세로토닌 (5HT) 활성화가 가리비와 phosphatidic 산성 (PA) 모두의 생산을 필요로 설립 우리에게 허용되었습니다 translocation 1-2. 중요한 것은, 같은 신경을 시각화하는 능력은 반복해서 우리가 예를 들어, 정교한 세부 3 PKC 응답의 desensitization를 측정할 수있다. 이 비디오에서는, 우리는 Sf9 세포 문화를 준비하는 각 단계를 보여, Aplysia 감각 뉴런의 문화가에 대한 응답으로 Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런과 PKC translocation 라이브 영상에 찬란 태그 PKCS을 표현, 다른 영상 제 4에 설명되어있다 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 다른 activators.
Protocol
1. 준비 및 Sf9 세포 Monolayer 문화의 유지 보수 Sf9 세포 배양 및 유지 관리는 조직 문화 후드에서 수행됩니다. Sf9 세포 Spodoptera frugiperda의 난소 세포 (Sf21 세포)에서 파생되며 Invitrogen에서 그레이스의 미디어에 냉동 세포로 구입할 수 있습니다. 보충 그레이스의 곤충 매체 (1X), 30 % 태아 소 혈청 (FBS) canted 목이 75cm 2 세포 배양 플라스크에 추가되었습니다. 장소 8 ML …
Discussion
우리는 Sf9 세포와 감각 뉴런 Aplysia에서 실시간으로 찬란 태그 PKCS의 이미지 translocation에 기술을 설명합니다. culturing 그들을 transfecting 아주 스트레이트 포워드이기 때문에 Sf9 세포 이미지 PKC translocation하는 간단한 시스템을 제공합니다. 대조적으로, Aplysia 감각 뉴런의 microinjection은 주인에게 몇 시간이 걸립니다, 최대 몇 개월까지. 이 기법에 관한 어려움 전극 막히는가 포함되어 있습…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 웨인 S. Sossin으로 보건 연구 (CIHR) 부여 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 캐롤 A. 파라이 드 라 퐁 물리 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ)와 콘라드 해링턴 교제에서 박사 후 교제의 수상자이다. 저자는 그래픽 개요 도움 비디오 촬영과 매들린 리치몬드 풀에 대한 도움 조애너 부기, 마가렛 헤이스팅스와 마가렛 Labban 감사하고 싶습니다.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Sf9 frozen cells
Spodoptera frugiperda ovarian cells
Invitrogen
B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid
Reagent
Gibco
11605-094
Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask
Tool
Corning
430720
Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum
Reagent
CanSera
CS-C08-500
Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe
Tool
Becton Dickinson
309604
Use to filter Fast Green solution
Syringe
Tool
Becton Dickinson
309602
Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter
Tool
Corning
431229
Use to filter Fast Green solution
Filter
Tool
Corning
431212
Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish
Tool
Mattek
P35G-1.5-14-C
Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent
Reagent
Invitrogen
10362-100
Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF
Reagent
Sigma-Aldrich
F-7252
Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries
Tool
World Precision Instruments
TW100F-4
Use to make microelectrodes for microinjection
Microloader pipette tip
Tool
Eppendorf
CA32950-050
Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection
Farah, C. A., Sossin, W. S. Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2516, doi:10.3791/2516 (2011).