Live-avbildning av PKC translokation hos Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner

Summary

I denna video visar vi visualisering av PKC translokationen i levande celler med fluorescerande taggade PKCS.

Abstract

Proteinkinas Cs (PKCS) är serine treonin-kinaser som spelar en central roll i regleringen av en mängd olika cellulära processer såsom celltillväxt och inlärning och minne. Det finns fyra kända familjer av PKC isoformer hos ryggradsdjur: klassiska PKCS (α, βI, βII och γ), ny typ jag PKCS (ε och η), ny typ II PKCS (δ och θ) och atypiska PKCS (ζ och ι ). De klassiska PKCS aktiveras av Ca ^{2 +} och diacylclycerol (DAG), medan romanen PKCS aktiveras av Dag, men är ^{Ca2 +-oberoende.} De atypiska PKCS aktiveras av varken Ca ^{2 +} eller DAG. I Aplysia californica, vår modell för att studera minnet bildas, finns det tre nervsystemet specifik PKC isoformer en från varje större klass, nämligen den konventionella PKC APL jag, romanen typ I PKC APL II och atypiska PKC APL III. PKCS är lipid-aktiverade kinaser och därmed aktivering av klassiska och nya PKCS som svar på extracellulära signaler har ofta korrelerad med PKC translokation från cytoplasman till plasmamembranet. Därför har visualisera PKC translokation i realtid i levande celler blir ett ovärderligt verktyg för att belysa signaltransduktionsvägar som leder till PKC aktivering. Till exempel har denna teknik möjlighet för oss att konstatera att olika isoformer av PKC translocate under olika förhållanden för att förmedla olika typer av synaptisk plasticitet och att serotonin (5HT) aktivering av PKC APL II krävs produktion av både Dag och fosfatinsyra (PA) för translokation ^1-2. Viktigt är förmågan att visualisera samma neuron upprepade gånger har gjort att vi, till exempel för att mäta hyposensibilisering av PKC svar i utsökt detalj ^3. I den här videon visar vi varje steg för att förbereda Sf9 cellkulturer har kultur Aplysia sensoriska neuroner har beskrivits i en annan video artikel ^4, uttrycka fluorescerande taggade PKCS i Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner och live-avbildning av PKC translokationen som svar på olika aktivatorer med hjälp av laser-scanning mikroskopi.

Protocol

1. Upprättande och underhåll av Sf9 cellodlingar monolager

1. Sf9 cellkultur och underhåll utförs i en vävnad kultur huva.
2. Sf9 celler kommer från Spodoptera frugiperda äggstockscancer celler (Sf21 celler) och kan köpas som frysta celler i Graces media från Invitrogen.
3. Plats 8 ml Grace insekt medelstora kompletteras (1X), till vilken 30% fetalt bovint serum (FBS) har lagts till i en 75 cm ² cellodling kolv med en snedställd hals.
4. Tina frysta tub Sf9 celler snabbt i ett 37 ° C vattenbad genom att flytta röret fram och tillbaka (ca 1-2 minuter).
5. Överföring Sf9 celler till 75 cm ² cellodling kolv och rock platta försiktigt för hand för att fördela de celler jämnt.
6. Inkubera 1-2 timmar vid 27 ° C tills celler har bifogas.
7. Ta bort gamla medium och ersätta med 10 mL freshGrace s insekt medium med 30% FBS.
8. Inkubera vid 27 ° C tills cellerna är konfluenta.
9. För att behålla cellslager kulturer, ta bort gamla medel från konfluenta kolv Sf9 celler och tillsätt 5 ml Grace insekt medium med 10% FBS.
10. Lätt tryck på sidan av kolven flera gånger för att lossa Sf9 celler.
11. Med hjälp av en 10 ml pipett och en pipett, media pipetten upp och ner en gång försiktigt, sprutning kolv väggen medan pipettera ned. Överför cellerna till en steril 15 ml Polysterene rör.
12. Tillsätt 2 ml Sf9 cellsuspension till 8 ml Grace insekt medium med 10% FBS (1:5 spädning för att bibehålla tillväxt logga fas) i ett nytt 75 cm ² cellodling kolv och rock platta försiktigt för hand.
13. Inkubera vid 27 ° C tills de celler konfluenta.

2. Redovisning av fluorescerande taggade PKCS i Sf9 celler

1. För live-imaging experiment, kultur Sf9 celler på 35 mm Mattek glas botten kultur disheswith en glasyta på 14 mm och ett täckglas tjocklek på 0,16 till 0,19 mm.
2. PKCS märkta med fluorescerande proteiner uttrycks i Sf9 celler med Cellfectin II transfektion reagens efter tillverkarens rekommendation med ändringarna nedan.
3. Dag 1: Innan bordläggningen cellerna, behandla varje Mattek skålen med Grace insekt medium med 10% FBS i minst 30 minuter.
4. Räkna Sf9 celler från steg 11 (ovan) med hjälp av en hemacytometer.
5. Plate 0,05 x 10 ⁶ celler på varje Mattek glas täckglas i en total volym på 150 mikroliter. Låt cellerna att fästa i 30 minuter vid rumstemperatur.
6. Tillsätt 2 ml Grace kompletteras med 10% FBS till varje maträtt 1 ml i taget långsamt för att undvika loss celler.
7. Inkubera vid 27 ° C över natten.
8. Från och med nu använder tillverkarens rekommendation för transfektion av Sf9 celler med plasmid-DNA.
9. Dag 2: transfektera Sf9 celler med fluorescerande taggade PKCS med Cellfectin II transfektion reagens. Vi har ofta samarbete som uttrycks i detta system PKCS taggade med förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) och monomera röda fluorescerande protein (mRFP) (detaljer för plasmid konstruktion har beskrivits tidigare ^2,5). Redovisning av ett fluorescerande protein i taget ger ca 70-80% innehållande celler 72 timmar efter transfektion. Co-uttryck av två fluorescerande proteiner minskar transfektion effektivitet till ca 30% samtidigt som uttrycker celler. Vid samtidig uttrycker EGFP-märkta PKC och mRFP-märkta PKC, använda 2x mer plasmid DNA till mRFP-märkta proteinet för optimal protein uttryck.
10. Spela live-imaging 48-72 timmar efter transfektion (för optimal proteinuttryck, vänta 72 timmar).

3. Redovisning av fluorescerande taggade PKCS i Aplysia sensoriska neuroner

1. Beredning av Aplysia neuronal cellkulturer har beskrivits i en video artikel av Zhao och kollegor ^4.
2. PKCS märkta med fluorescerande proteiner uttrycks i Aplysia sensoriska neuron med hjälp av mikroinjektion förfarande som beskrivs nedan.
3. Bered en stamlösning av 1% Snabbt Green (FCF) i destillerat vatten, filtrera hjälp av en spruta och en 28 mm sprutfilter (0,20 mikrometer). Alikvotera och förvara vid -20 ° C.
4. Mikroinjektion av sensoriska nervceller kan göras på dag 1 eller dag 2 efter att isolera nervceller, men vi tycker att vänta två dagar ger bättre cell anslutning till täckglas.
5. Dag 2 efter isolering av sensoriska neuroner, tina en alikvot av Snabb grön och filtrera det igen med hjälp av en spruta och en 28 mm sprutfilter (0,20 mikrometer).
6. Bered en lösning av plasmid DNA i destillerat vatten som innehåller 0,5% Snabb Green. Halterna av plasmid-DNA så hög som 0,4 mikrogram / mikroliter kan användas men det är inte rekommenderat att gå över dessa värden.
7. Filtrera plasmid DNA / Snabb Grön med hjälp av en 1 ml spruta och en 4 mm sprutfilter (0,20 mikrometer).
8. Centrifugera plasmid DNA / Snabb grön lösning på 16.110 xgi 15 minuter med en mikrofonrocentrifuge.
9. Förbered skarpa elektroder för mikroinjektion av nervceller med hjälp av en mikroelektrod avdragare (Sutter Flaming / Brown Mikropipett avdragare, modell P-97). Med hjälp av en låda glödtråd, dra glas microelectrodes med 1 mm ytterdiameter, 0,75 mm innerdiameter och 100 mm längd med tunn vägg glas kapillärer med en glödtråd inuti (World precisionsinstrument TW100F-4). För mer information om att dra mikroinjektion elektroder se Sutter elektrod kokbok.
10. Fyll varje elektrod med 2 mikroliter av plasmid DNA / Snabb grön lösning med microloader pipettspetsen (Eppendorf CA32950-050).
11. Överför Mattek glasskål botten kultur innehåller Aplysia neuronala kulturer till mikroinjektion stationen.
12. Det mikroinjektion stationen består av följande: en hemmagjord stort glas scenen för att hålla kulturen rätter på en vibrationsisolering tabell (Kinetic Systems vibrationsisolering arbetsstation), en stereo-scope med externa halogenbelysning, ett mikromanipulator (Sutter Huxley Wall Typ mikromanipulator som tillåter både grova och ultrafina positionering i de tre-axeln), en mikroelektrod hållare kopplad till en pneumatisk pump (World precisionsinstrument PV820 Pneumatisk Pico-pump). Trycket Inmatning av pneumatiska pumpen är ansluten till en komprimerad Kväve tank.
13. Sätt in en mikroelektrod i mikroelektrod hållaren.
14. Visar under ett stereomikroskop in spetsen av mikropipett in i cellkärnan.
15. Leverera korta tryckpulserna kväve (10 till 100 ms i längd, 20 lb / in ²⁾ tills kärnan blir uniformely grön.
16. Inkubera cellerna i 4 timmar i rumstemperatur och förvara vid 4 ° C fram till användning. För optimal PKC translokation, uppträder live-imaging experiment från 20 till 24 timmar efter injektion.

4. Visualisering av PKC translokation hos Living Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner

1. För bildbehandling använder vi en Zeiss LSM510 inverterat konfokalmikroskop med en Axiovert 200.
2. Bildprotokoll är samma för Sf9 celler och för Aplysia sensoriska neuroner med undantag för följande: Sf9 celler är avbildade med en x63 oljeimmersion mål medan Aplysia sensoriska nervceller är avbildade med en x40 oljeimmersion mål. Sf9 celler är avbildad i en temperaturkontrollerad kammare hålls vid 26-27 ^° C medan Aplysia sensoriska nervceller är avbildade i rumstemperatur upprätthålls runt 18-20 ^° C.
3. Vi använder en 30 mW Argon laser (magnetisering vid 488nm) med 50% laserutskrifter till bild PKC taggade med EGFP protein och en HeNe laser (magnetisering vid 543nm) för att bilden PKC taggade med mRFP protein. Argon och HeNe laserlinjer dämpas till 4% och 50% sändareffekt respektive före bildbehandling och hål är anpassat till en.
4. Det är viktigt att ha den kultur maträtt stabiliserats på avbildning scenen och för att undvika rörelse eller vibration.
5. Ta 1 ml av kultur media från skålen försiktigt med en 10 ml pipett lämnar 1 mL totala volymen i skålen.
6. Ta bilder i den mellersta delen av de celler där kärnan syns.
7. Sätt upp en tidsserie av 10-20 konfokala bilder du tar en bild var 30 sekund.
8. Starta tidsserier.
9. Efter 2 bilder tas (efter 30 sekunder tidpunkt), tillsätt 1 ml av läkemedlet (2X koncentration) försiktigt drop-by-drop på toppen av cellerna med hjälp av en P1000 pipett. Drogen läggs kontinuerligt under ca 30 sekunder.
10. Vissa läkemedel inducerar ett snabbt translokation som kan vara synliga omedelbart efter läkemedelsbehandling (vid 60 sekunder tidpunkt), medan andra framkalla en långsam translokation som bara är optimalt 5-10 minuter efter avslutad behandling (Film 1 och Film 2).
11. Om läkemedlet måste tvättas bort, använda 2 x 10 ml pipetter att göra tvätta, pipettera den tvättbuffert ner försiktigt med en pipett på ena sidan av skålen och pipeting upp media på andra sidan.
12. Om tvätt har varit effektiv och om effekten av läkemedlet är reversibel, återgår PKC tillbaka till cytosolen inom 30-60 sekunder.
13. Spara filmen som en LSM-fil.
14. Använd NIH Image J programvara för att öppna LSM filer och kvantifiera bilder före och efter läkemedelsbehandling. Kvantifiering har beskrivits någon annanstans ^1.

Discussion

Vi har beskrivit en teknik för att bilden förflyttning av fluorescerande taggade PKCS i realtid i Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner. Sf9 celler ger ett enkelt system för att bilden PKC translokation sedan odling och transfecting dem är ganska enkel. Däremot tar mikroinjektion av Aplysia sensoriska neuroner lite tid att bemästra, upp till några månader. Svårigheter i samband med denna teknik inkluderar elektrod igensättning. Filtrering injektionslösningen och centrifugering det oftast hjälper men ibland luftbubblor kan bildas i elektroden när du fyller upp det. Vi anser att användning av microloader pipettspetsar för att fylla upp elektroden i stället för kapillärt bidrar till att minimera bildandet av luftbubblor. När det gäller live-bilder, två faktorer måste hårt kontrollerad under avbildning sessionen: temperatur och rörelse. Temperatursvängningar kan påverka translokation och användning av en temperaturkontrollerad kammare bör övervägas. För att undvika rörelser under Imaging kan en vibrationsisolering tabell användas.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Sf9 frozen cells	Spodoptera frugiperda ovarian cells	Invitrogen	B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11605-094	Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask	Tool	Corning	430720	Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum	Reagent	CanSera	CS-C08-500	Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe	Tool	BD Biosciences	309604	Use to filter Fast Green solution
Syringe	Tool	BD Biosciences	309602	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431229	Use to filter Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431212	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish	Tool	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C	Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent	Reagent	Invitrogen	10362-100	Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F-7252	Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4	Use to make micr–lectrodes for microinjection
Microloader pipette tip	Tool	Eppendorf	CA32950-050	Autoclave before using to fill up the micr–lectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump	Tool	World Precision Instruments, Inc.	SYS-PV820	Part of microinjection station
Micr–lectrode holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH6S	Use to hold micr–lectrode
Micromanipulator	Tool	Sutter Instrument Co.	MP-85	Use to position micr–lectrode in the three-axis