Summary
В этой статье мы представляем микрожидкостных основе метода удержания частиц на основе гидродинамических потоков. Мы демонстрируем стабильный захват частиц в точке застоя жидкости с помощью механизма управления с обратной связью, что позволяет камере и микроманипуляция произвольных частиц в интегрированной микроустройство.
Protocol
Гидродинамическая ловушка состоит из двухслойной гибридных (полидиметилсилоксан (PDMS) / стекло) микрожидкостных устройство для удержания частиц. Шаги 1-2 описывают изготовление микрожидкостных устройств, а также шаги 3-4 устройство обсудить проектирования и эксплуатации.
1. SU-8 Mold Изготовление (не показано на видео)
- Чистая два кремниевых пластин (3 "в диаметре) с ацетоном и изопропиловый спирт (IPA).
- Сухие вафли с N 2 и разместить их на плите при температуре 65 ° С в течение 1 мин для удаления остатков влаги.
- Спиновые пальто пластины № 1 с SU-8 2050 фоторезиста (PR) в течение 30 сек при 4000 оборотов в минуту для создания ~ 40 мкм формы для жидкостного слоя. Спиновые пальто пластины № 2 с PR в течение 30 сек при 1500 оборотов в минуту, чтобы создать ~ 150 мкм формы для управления слоем.
- Мягкие пластины испечь № 1 при 65 ° С в течение 3 мин, а затем при 95 ° С в течение 6 мин. Мягкие пластины испечь № 2 при 65 ° С в течение 5 мин, а затем при 95 ° С в течение 20 мин.
- Expose пластин к УФ с соответствующими масками (пластины № 1: порты и жидкостных каналов, вафельные # 2: порт и уровень управления) и соответствующей интенсивности воздействия (~ 150 мДж / см 2, ~ 260 мДж / см 2 соответственно).
- Сообщение выпекать пластины № 1 при 65 ° С в течение 1 мин, а затем при 95 ° С в течение 6 мин. Сообщение выпекать пластины № 2 при 65 ° С в течение 5 мин, а затем при 95 ° С в течение 10 мин.
- Разработка пластин с пропиленгликоль метиловый эфир уксусной кислоты (PGMEA) до неотвержденного PR удаляется. Промыть вафли с МПА и сухой с N 2.
2. Изготовление микрожидкостных устройств
- Silanize поверхности SU-8 форм путем размещения пластин в эксикаторе под вакуумом в течение ~ 10 мин с стеклянное блюдо с добавлением нескольких капель трихлорсилана. Поверхность silanization помогает пилинг (PDMS) реплик от SU-8 пресс-форм.
- Смешайте и дегазации PDMS в базе: сшивателя отношения 15:01 и 5:1 для жидкостных и контроля слоев соответственно.
- Спиновые пальто 15:01 смесь PDMS на жидкостный плесень слоя (пластины № 1) в течение 30 сек при 750 оборотах в минуту и затем поместите пластину в чашку Петри. Место плесень уровень управления в чашку Петри и залить 5:01 PDMS смесь на плесени толщиной ~ 4 мм.
- Выпекать пластин / PDMS в течение 30 мин при 70 ° С частично вылечить PDMS слоев.
- После охлаждения пластин / PDMS до комнатной температуры, вырезать PDMS реплики, который будет служить уровень управления (пластины № 2), из чашки Петри с помощью скальпеля и очистить его от SU-8 плесени. Пробойниками порта доступа к микроканальных который будет действовать как на-чипе мембраны клапана с 21 иглой.
- Место PDMS реплики с контролем слой на пластине № 1 (который спин-покрытием PDMS жидкостный слой). Тщательно выровняйте и печатью управления слой жидкостный слой с помощью стерео микроскопа. Убедитесь в том, чтобы удалить все воздушные полости между слоями и запекать при температуре 70 ° С в течение ночи, чтобы полностью вылечить обоих слоев. Это выпечки шаг приведет к монолитной плиты PDMS с двумя слоями.
- После охлаждения до комнатной температуры, разрезать и очистить PDMS реплики, содержащие как контроль и жидкостный слои от SU-8 плесень с помощью скальпеля. Удалите излишки PDMS и отдельно каждого устройства, блок с лезвия бритвы. Пробойниками доступ к портам в микроканалов жидкостного слоя с 21 иглой.
- Бонд плиты PDMS, чтобы покровное для получения полного устройства. Во-первых, чистый покровное (Нет: 1,5, 24 х 45 мм) с ацетоном и МПА. Далее, как относиться к покровным и PDMS реплики поверхности с кислородной плазмы до 500 мторр в течение 30 сек, и немедленно принести двух поверхностей в контакт с формой необратимым печатью.
- Выпекать устройств на ночь для увеличения сцепления между слоями PDMS и покровное.
Шаги 3-4 описывают реализацию гидродинамические ловушки использованием микрожидкостных устройств, описанных выше.
3. Гидродинамические Ловушка Экспериментальная установка
- Место микрожидкостных устройств на этапе инвертированного микроскопа и закрепите ее стадии клипов.
- Заполните два газонепроницаемые шприцы отдельно с буфером и образцы решений и разместить их на шприц Гарвардского Аппарат насоса (PHD 2000 программируемых). Буфера и образцы решений доставляются микрожидкостных устройств с помощью 1 мл и 250 мкл шприц, соответственно. Как правило, 50 мМ Трис / Tris HCl буферного раствора (рН 8,0), содержащим 0,02% об. / Triton X-100 используется в качестве буферного раствора. Пример решения состоит из суспензии частиц (например, люминесцентных бисером полистирол) в буферный раствор.
- Создание жидкостных связей между шприцы (доставки пробы и буфера) и микрожидкостных устройств. Подключите шприцы на 1 / 16 "наружный диаметр (OD) х 0,020" внутренний диаметр (ID) perfluoroalkoxy (PFA) трубки использованием Луер-Лок адаптеров. Подключите другой конец трубки PFA на входе портов микрожидкостных устройств с калибра 24 метал труб. Т-клапан может быть помещен между шприца образец и пример порт микрожидкостных устройство контрольной пробы доставки.
- Создание жидкостных соединений для выхода каналов в микрожидкостных устройств. Подключите два канала выхода в трубку PFA (1 / 16 "OD х 0,020" ID) с помощью 24 металлической трубы. Трубки PFA для выходов должны быть равной длины. Опустите обе розетки трубы в 1,5 мл центрифуге трубки, заполненной буферным раствором, который служит для поддержания постоянного перепада давления между шприцами и выходе каналов.
- Заполните на-чипе клапан с фторированные масла перевозчика, используя 3 мл Луер-Лок пластиковый шприц, чтобы предотвратить утечку воздуха в жидкостный слой во время работы. Воздух в камеру клапана выталкивается через мембрану PDMS в микроканальных в жидкостный слой, а затем удаляются из устройства с потоком жидкости через выпускные отверстия.
- Подключение под давлением инертного газа (азота) поставки до порта в управление слой для на-чипе клапана. Для этой цели мы используем азота танк (2200 фунтов на квадратный дюйм) и электронным регулятором давления на поставку 0-30 фунтов на квадратный дюйм, чтобы на-чипе клапан в микрожидкостных устройств. Азот бак соединен с регулятором давления использованием ¼ "OD х 0,170" ID трубки. Регулятор давления подключен к микрожидкостных устройства через 1 / 16 "OD х 0,020" ID PFA трубы с 24 металлической трубы на ее конце.
- Промыть жидкостного соединения и микрожидкостных устройство с 0,5 мл буферного раствора, чтобы все пузырьки воздуха удаляются из системы, включая выходные каналы. Типовые значения расхода, используемая для очистки пузырей в диапазоне от 2000-5000 мкл / час. После воздушных пузырьков происходит промывка из микрожидкостных каналов, снизить расход до 50-100 мкл / час, что является типичным объемного расхода для улавливания частиц.
- На данный момент, жидкостного соединения устанавливаются, образца и буферных растворов доставляются микрожидкостных устройств с фиксированной скоростью потока (50-100 мкл / час), и устройство готово для гидродинамических ловушек.
4. Гидродинамические Процедура Треппинг
- Выполнить заказ LabVIEW код, который автоматизирует захват частиц (см. Примечание об использовании для LabVIEW код ниже).
- Использование перевода микроскопом ху этапе положение области захвата (кросс-слот) в центре камеры. Принесите области захвата в фокус объектива и отрегулировать настройки камеры для оптимизации изображений условиях.
- Выбор прямоугольной области интереса (ROI) в поле зрения камеры, что центр ROI будет положение центру ловушки.
- Инициализация компенсировать давление на на-чипе клапана. В одном из розетки каналов, 100-200 мкм, сужения вводится обеспечить смещение давление на-чипе клапана. Постоянной вне установленного давления позволяет на-чипе клапан для регулировки положения критической точки в непосредственной близости от центра канала кросс-слот. Для большинства экспериментов, компенсировать давление находится между 0-12 фунтов на квадратный дюйм в зависимости от размеров канала (по высоте и ширине), сужение ширины и спецификации на-чипе клапан (клапан размер, толщина мембраны и т.д.).
- Инициировать обратной связи контроллера и настройки пропорционального усиления оптимизировать ловушку ответ. Обратная связь контроллер будет регулировать давление на на-чипе клапан для того, чтобы изменить положение критической точки, что позволяет минимизировать ошибки или расстояние между положением частицы и уставки (ловушки в центре). В зависимости от скорости потока и на-чипе положения клапана, существует оптимальное значение пропорционального усиления, что повышает стабильность ловушку и устраняет нежелательные колебания частиц.
- Ловушка частицы. Код LabVIEW автоматически ловушку одной из частиц, входящих области захвата. Как только желаемый частиц в ловушке, можно перекрыть поток пробы и изолировать захваченные частицы в буферный раствор, если это необходимо.
- Монитор запертых частиц и поддержания частиц фокус в плоскости изображения с помощью ручного фокуса или автоматизированные установки микроскопа фокус. Это может быть необходимо, чтобы немного изменить пропорциональный коэффициент усиления обратной связи контроллера с целью обеспечения стабильности ловушки в течение длительного времени масштаба захвата события (минут до нескольких часов).
LabVIEW Код: Примечание об использовании для обратной связи контроллера
Автоматизированная захвата частиц достигается при использовании линейного алгоритма управления с обратной связью реализованы с помощью специального кода LabVIEW. Код LabVIEW захватывает изображения с ПЗС-камерой и передает электрический потенциал (напряжение), чтобы регулятор давления, который активно модулирует позиции (частично открытый / закрытый состоянии) на-чипе динамический клапан пневматические. Как положения клапана изменения, гидродинамические скорости потока в одной выходной линии яс учетом, тем самым повторное позиционирование критической точки и создание благоприятных гидродинамических ловушек. Шаги в цепи обратной связи последовательно и многократно выполняется со скоростью захвата изображения (10-60 Гц). LabVIEW кода выполняет следующие действия в течение каждого цикла обратной связи:
- . Захват изображения изображение, приобретенных для "мишень" частицы в области захвата из микрожидкостных устройств с помощью флуоресцентной микроскопии с 10-кратным объективом (NA: 0,4) и ПЗС-камерой.
- Частица слежения. Частица центроида положение определяется, и алгоритм отслеживания частиц начинается. Частицы локализованы путем установки профиля интенсивности излучения частицы функция размытия точки (ФРТ), из которых центр тяжести положение определяется.
- Поток управления полем. Обновленной давления предназначен для на-чипе динамических клапана вычисляется с использованием алгоритма управления с обратной связью с пропорциональным контроллером. Таким образом, действие клапан повторно положение критической точки, что оказывает гидродинамические силы на частицу, с тем чтобы спроецировать частицы к центру ловушки.
Код LabVIEW записи следующие данные для каждого изображения, снятого во время захвата частиц: 1) время, прошедшее, 2) центр тяжести (х, у) положение запертых частиц, 3) положение центра ловушки, 4) расстояние частицы от центру ловушки, 5) давление на на-чипе клапана. Кроме того, код также записывает фильма запертых частиц в формате AVI.
5. Представитель Результаты
Мы ловушке флуоресцентного бисера полистирола различного размера (100, 540, 830 нм и 2,2 мкм в диаметре) с помощью гидродинамической ловушке. Рисунок 1 () показывает образ частицы, захваченной на перекрестке слот перехода в микрожидкостных устройств. Траектория запертой частицы могут быть определены непосредственно из центра тяжести данные о положении записан код LabVIEW во время захвата события или путем отслеживания и локализации ловушку частицы из записанных видеофайлов. Рисунок 1 (б) показана траектория запертой частицы (2,2 мкм флуоресцентные полистирола шарика) в направлении канала розетки. Бусинка изначально ловушку (квадраты) в течение 3 мин, а затем освобождены из ловушки и уходит вдоль одного из каналов выхода (кружки). Траекторий частиц вдоль оси сжатия потока (направление входа канала; данные не приведены) похожи на траектории частиц вдоль оси экстенсиональным поток (отток направлении), как показано на рисунке 1 (б). Гистограмма смещения частиц из ловушки центр ловушку шарик (2,2 мкм в диаметре) по направлениям выходе канала показан на рисунке 1 (с). Использование алгоритма управления с обратной связью, описанные в этой работе, попавшие частицы удерживаются в пределах ± 1 мкм центру ловушки вдоль входе и направления выхода канала.
Схема микрожидкостных устройств, используемых для гидродинамических захвата показано на рисунке 2. Интегрированные микрожидкостных Устройство состоит из жидкостных слой и слой управления, и изготовлен с использованием стандартных многослойных мягкой литографии, как описано в этой статье. Жидкостный слой содержит буфер и образцы каналов, а также кросс-слот геометрии канала для облегчения гидродинамических ловушек. Уровень управления состоит из пневматический клапан расположен над одним из розетки каналов в жидкостный слой, и контроля и жидкостный слои разделены тонкой мембраной эластомерных. Во время работы устройства, клапан контроля слой под давлением газообразного азота, которая заставляет тонкую мембрану в жидкостный слой, тем самым вызывая сужение на выходе канала. Динамический клапан пневматического сужает выходе канала переменного объема, изменяя давление на уровень управления, который регулирует относительные скорости потока на выходе каналов и позволяет мелкомасштабных контроль критической точки.
Рисунок 1: Захват частиц. (А) Изображение одного шарик заключен в гидродинамической ловушке. В дополнение к бусину на ловушку центр, несколько бусин пролетные показаны в области захвата. (Б) траектория запертой частицы по выходе каналов (квадраты). Когда частица выходит из ловушки (стрелка), он уходит вдоль одного из каналов выхода (кружки). (С) Гистограмма смещения ловушку шарик (2,2 мкм в диаметре) из ловушки центра по выходе каналов.
Рисунок 2:. Схема микрожидкостных устройство для гидродинамических захвата гидродинамическая ловушка строится с помощью двухслойной микрожидкостных устройств. Жидкостный слой состоит из образца входе, енаш буфер заливы, и два выхода отходов. Уровень управления состоит из клапана пневматического мембранного расположен на вершине одного из розетки каналов в жидкостный слой. Сужение в противоположных выходе канала обеспечивает смещение давления для пневматических клапанов. Типовые размеры канала в диапазоне от 100-500 мкм. В области (), образец входе потока фокусируется два входа буфера. В области (В), противоположные потоки входе сходятся в кросс-слот перекрестке, где захват происходит. Клапан пневматический (C) расположен на вершине одного из розетки каналов. Положение критической точки модулируется регулирования давления в этом клапане.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Текущий микрожидкостных методы манипуляции частиц на основе гидродинамического потока можно охарактеризовать как контакт основе или бесконтактные методы. Контакт-методов, основанных на использовании жидкости физически ограничивать и останавливать частицы против microfabricated стенок канала 9, в то время как бесконтактные методы основаны на циркулирующего потока или microeddies 10. В этой работе мы представляем метод свободных частиц решение захвата использованием единственного действия потока жидкости. Гидродинамические ловушки позволяет камере и манипуляции мелких частиц в точке жидкости застой в микрожидкостных кросс-слот устройства. В этом устройстве, автоматизированный механизм управления с обратной связью используется, чтобы ограничить частиц мелкомасштабных и активной регулировки положения критической точки в текущей жидкости.
Что такое герметичность лишения свободы для частиц в гидродинамической ловушке и как это можно оптимизировать? Точность удержания частицы к центру ловушки зависит от точности определения центра тяжести при локализации положения частицы. Для достижения надежного захвата частиц, пользователь должен обеспечить максимальную контрастность изображения между частицей и фон для оптимального отслеживания и локализации. Кроме того, особое внимание должно быть принято, чтобы избежать пузырей или мусора в микроканалов, которые могут повлиять на частицу слежения. Стабильным источником потока должны быть использованы для минимизации возмущений в жидкости, так как стабильность положения точки торможения чувствителен к колебаниям потока. Используя этот подход, гидродинамических жесткость ловушка была измерена равной ~ 1E-4 пН / нм в течение ~ 2 мкм частиц 1, что сравнимо с альтернативными методами, включая электрокинетические ловушки или оптического пинцета. Micron масштаба частицы удерживаются в пределах 1 мкм центру ловушки в течение длительного периода времени, что позволяет для точного позиционирования и манипуляции частицами в свободном растворе. С дальнейшим развитием технологии, захваченных частиц может быть временно подвергаются переменным микросреды, когда муфта гидродинамическая ловушка с химическими градиентами генерируется с использованием ламинарного течения в микроканалов. Наконец, гидродинамический захват происходит при критической точки, где конвекция жидкости стремится к нулю. В идеальной ловушки, частицы удерживаются на месте нулевой скорости жидкости, где движение частицы в значительной степени доминируют броуновское движение. С этой точки зрения гидродинамических ловушка, не pertubative метод захвата на основе непрерывного потока жидкости.
Гидродинамические захвата и манипуляции легко достигается для любого произвольного "целевой" частиц, учитывая, что частицы могут быть отображены, отслеживается, и локализованным использованием оптической микроскопии. Таким образом, люминесцентные и флуоресцентные не-частицы и неизотропных объекты могут оказаться в ловушке без учета химических / физических / оптический характер запертых частиц. Кроме того, гидродинамические ловушки могут быть легко интегрированы в существующую мягкой литографии основе микрожидкостных систем без необходимости в сложных изготовления, структурирование электродов или обширные оптических установок. Гидродинамическая ловушка недорогой и удобный инструмент для захвата частиц с минимальным лабораторное оборудование требованиям, в том числе микрожидкостных устройств, регулятор давления, а также компьютерные обратной связи контроллера. В целом, гидродинамические ловушки потенциал для преобразования фундаментальной и прикладной науки исследования микро-и наноразмерных частиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим группу Kenis в университете штата Иллинойс в Урбана-Шампейн за полезные обсуждения и щедро обеспечение использования чистых объектов.
Эта работа финансировалась Путь к NIH премии Независимости П.И., под грант № 4R00HG004183-03 (Charles M. Шредер и Melikhan Tanyeri).
Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда через стипендий для исследований Эрик М. Джонсон-Чаварриа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 gauge blunt needle | Zephyrtronics | ZT-5-021-1-L | For punching port holes in PDMS |
| 3 ml plastic syringe | BD Biosciences | 309585 | For filling valve with oil |
| Si wafers | University Wafer | 3” P(100) single side polished 380 μm test grade | |
| Cover glass | VWR international | 48404-428 | 24 x 40 mm #1.5 |
| DAQ card | National Instruments | PCI 6229 | |
| Fluorescent beads | Spherotech, Inc. | FP-2056-2 | 2.2 μm Nile red |
| Fluorinert | 3M | FC 40 | Fluorinated carrier oil |
| Inverted Microscope | Olympus Corporation | IX-71 | |
| LabVIEW | National Instruments | Version 9.0f3 (32bit) | |
| Stereo Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | For aligning PDMS control layer to fluidic layer. |
| Mechanical Convection Oven | VWR international | 1300U | For baking devices to create monolithic PDMS slabs with two layers. |
| Microfluidic tubing and connectors | Upchurch Scientific | 1/16 x .020 PFA tubing and super flangeless fittings | |
| PDMS | GE Healthcare | RTV 615 A&B | |
| Plasma Chamber | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-001 | |
| Pressure Transducer | Proportion Air | DQPV1 | |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 Spin Coat | |
| Photoresist | MicroChem Corp. | SU 8 2050 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 Programmable | |
| Terminal Block | National Instruments | BNC 2110 | For analog output to pressure regulator and read out. |
| UV Collimated Light Source and Exposure System | OAI | Model 30 Enhanced Light Source |
References
- Tanyeri, M., Johnson-Chavarria, E. M., Schroeder, C. M. Hydrodynamic Trap for Single Particles and Cells. Applied Physics Letters. 96, 224101-224101 (2010).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Optics Letters. 11, 288-290 (1986).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: Micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).
- Chiou, P. Y., Ohta, A. T., Wu, M. C., C, M. Massively parallel manipulation of single cells and microparticles using optical images. Nature. 436, 370-372 (2005).
- Cohen, A. E., Moerner, W. E. Method for trapping and manipulating nanoscale objects in solution. Applied Physics Letters. 86, 093109-09 (2005).
- Evander, M. Noninvasive acoustic cell trapping in a microfluidic perfusion system for online bioassays", Analytical Chemistry 79. , 2984-2991 (2007).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kim, M. C., Wang, Z. H., Lam, R. H. W., Thorsen, T. Building a better cell trap: Applying Lagrangian modeling to the design of microfluidic devices for cell biology. Journal of Applied Physics. 103, (2008).
- Lutz, B. R., Chen, J., Schwartz, D. T. Hydrodynamic tweezers: 1. Noncontact trapping of single cells using steady streaming microeddies. Analytical Chemistry. 78, 5429-5435 (2006).
