Summary
Polar lipid özler bireysel glycerolipids Kompozisyon ve yağ asidi kompozisyonu basit ve sağlam bir lipid profil deneyde belirlenir. Bu amaçla, glycerolipids ince tabaka kromatografisi ile izole edilir ve onların açil grupları transmethylation tabi. Yağ açil methylesters gaz-sıvı kromatografisi ile sayısallaştırılmış.
Abstract
Biyolojik membranlar ayrı hücreler çevreden. Fosfatidilkolin veya phosphatidylethanolamine, hücreleri ve çevreleri arasındaki kimyasal değişimi için hem sınırları ve arayüzleri olarak hareket form bilayeri membranlar gibi çok hücreli bitki ve hayvanlar, glycerolipids, tek bir hücre. Hayvanların aksine, bitki hücreleri fotosentez için özel bir organel kloroplast var. (MGDG) monogalactosyldiacylglycerol digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4: kloroplastın karmaşık membran sistemi yani benzersiz glycerolipids, fosfor eksikliği glikolipitler içerir. Bu lipitlerin rolleri sadece yapısal dışındadır. Bu glikolipitler ve diğer glycerolipids fotosistem I ve II fotosentez 8,11 glycerolipids katılımı gösteren kristal yapıları bulundu. Fosfat açlık sırasında, DGDG fosfolipitler 9,12 kaybını telafi etmek extraplastidic membranlar aktarılır.
Bu lipitlerin biyosentezi ve fonksiyon bilgimizin Arabidopsis thaliana 14 ile biyokimyasal ve genetik çalışmalar bir arada elde edilmiştir. Bu çalışmalar sırasında, polar lipid analizi için basit bir prosedür lipid mutantlar tarama ve analiz için gerekli ve detaylı olarak özetlenen olacaktır. Bir yaprak lipid özü ilk ince tabaka kromatografisi (TLC) ile ayrılmış ve glycerolipids iyot buharı ile geri dönüşümlü lekeli. Bireysel lipidler TLC plağı koparılmış ve alev iyonizasyon algılama (FID GLC) (Şekil 1) ile birleştiğinde gaz-sıvı kromatografisi ile analiz edilir yağ açil methylesters (Fames) dönüştürülür. Bu yöntem, mutant tarama için güvenilir bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Örneğin tgd1, 2,3,4 endoplazmik retikulum-plastid lipid kaçakçılığı mutantlar anormal bir galactoglycerolipid birikimine dayalı bulunmuştur: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) ve göreli 18:03 miktarda bir azalma (karbonlar: double bağ) 3,13,18,20 zarı lipidler yağ açil grupları. Bu yöntem ayrıca substrat 6 olarak lipidler kullanarak proteinlerin enzimatik faaliyetleri belirlemek için uygulanabilir.
Protocol
1. Lipid Ekstraksiyon
- 30 mg agar üzerinde yetiştirilen bitkiler 4 hafta eski Arabidopsis yaprakları orta ya da toprak katılaşmış ve 1,5 mL polipropilen reaksiyon tüpleri içine transfer hasat tarafından lipid ekstraksiyon başlayın. Taze yaprakları flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C'de saklanabilir.
- Metanol oluşan solvent 300 mcL çıkarma, kloroform ve formik asit (20:10:01, v / v / v) her numune ekleyin. (Bir boya Shaker ya da benzeri kullanarak) 5 dakika çalkalanır.
- 0.2 M fosforik asit (H 3 PO 4), 1 M potasyum klorür (KCl) ve vorteks kısaca 150 mcL ekleyin.
- 1 dakika boyunca oda sıcaklığında 13.000 xg'de santrifüjleyin. Alt kloroform fazında çözünmüş Lipidler TLC plakaları damlatılan olacaktır.
2. İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) 15
- Batığın 0.15 M amonyum sülfat ((NH 4) 2 SO 4) solüsyonu içine 30 saniye için şerit yükleme 20cmX20cm ile silika jel kaplı TLC plağı, TLC plakaları hazırlamak için, 30 saniye boyunca daldırarak sonra, en az 2 gün boyunca tabak kuru kapalı bir kapta. Etkinleştirme sırasında diğer glycerolipids ayrılması için gerekli phosphatidylglycerol protonates sülfürik asit, amonyum süblimasyon arkasında bırakır.
- Deney günü etkinleştirmek 120 fırında pişirme tarafından plakaları TLC ° C, 2,5 saat süreyle.
- Oda sıcaklığına kadar aktive edilmiş plakalar Soğuduktan sonra, plaka üzerinde kromatogram kökeni (plaka kenarından 1,5 cm) düz bir çizgi çizmek için bir kalem kullanın.
- Davlumbaz, yavaş yavaş bir akışı altında N 2 200 mcL sarı plastik ipuçları ile 20 mcL pipet kullanarak alt kloroform faz 3 X 20 mcL lipid özü teslim. Bu amaçla, bir Tygon Boru N 2 tank, regülatör bağlıdır. Spot çapı 1 cm'den daha küçük tutunuz. Her plaka 10 örnek (sonraki GLC analiz planlanan olduğunda) kadar tutabilir.
- Lipid davlumbaz tamamen kuru noktalar gibi, aseton, toluen, su (30 ml: 7.5 ml 91 ml) oluşan gelişmekte olan solvent hazırlar. Ortam bağıl nem yüksek ise, ayrılık etkilenebilir. Bu durumda istenen ayırım elde (7.0 ml: 30 ml 91 ml) su vermek azaltılmalıdır.
- 80 ml çözücü gelişmekte olan ve aşağı bakacak şekilde örnek sonuna tankına plaka odası (H: W = 27.0: 26.5 7.0 cm / cm / cm L) gelişmekte olan bir yapışmalı, TLC içine dökün. Tank kelepçe kullanarak Seal. Solvent plaka yükselmek ve lipidler ayrılacaktır. Geliştirme zamanını, oda sıcaklığında yaklaşık 50 dakika mesafededir.
- Çözücü ön plaka üstten 1 cm ulaştığında, dikkatlice plaka tanktan çıkarın ve yaklaşık 10 dakika için davlumbaz tamamen kuru.
- TLC ayrılmış Lipidler kantitatif analiz ya da sülfürik asit veya α-naftol geri dönüşümsüz lekeli iyot ile ya da geri dönüşümlü kısaca lekeli olabilir.
- Sülfürik asit yanmaları:% 50 sülfürik asit, davlumbaz ve fırında 120 ° C'de 15 dakika (Şekil 2A) spreyli cam bir şişede su spreyi plaka.
- glikolipitler için α-naftol boyama:% 2.4 (w / v)% 10 α-naftol (v / v), sülfürik asit,% 80 (v / v) etanol ve fırında 120 ° C plaka uygulaması için 3-5 glikolipid bantları kadar dakika (Şekil 2B), pembe veya mor lekeli. Aşırıtedavi reaktif sülfürik asit varlığı nedeniyle tüm lipidler yanmaları için yol açacaktır.
- İyot boyaması: davlumbaz plaka, iyot kristalleri ile kapalı bir TLC (lipidler görünür olana kadar iyot buharı ile atmosferin doygunluk önde gelen altındaki bir tepsi) tankı içine yerleştirin. Iyot iyot kovalent çoklu doymamış yağ asitleri (Şekil 2C) değiştirebilir gibi çok uzun plaka maruz bırakmayın. Alternatif olarak, örnek şeritli serpiştirilmiş sadece standart şerit N 2 ayrı standart şerit üzerinde üflenir iyot kristalleri ile Pasteur pipeti takılı bir cam yünü kullanılarak boyandı olmalıdır, lipidlerin herhangi bir oksidasyon önlemek için.
3. Yağ Asil metilester (FAME) Reaksiyon 16
- Bir jilet ile TLC plağı silika çevreleyen lipit noktalar tespit çıkarın. Lipit içeren silika kazıyın ve Teflon (PTFE) kaplı vidalı kapaklı cam tüp içine bir huni kullanarak silis tozu aktarımı.
- Cam pipet ile her bir örnek susuz metanol 1 ml 1 N hidroklorik asit (HCl) ekleyin.
- 200 mcL sarı plastik ucu ile 200 mcL pipet kullanarak iç standart olarak her numune için 200 mcL pipet kullanarak 100 mcL 50 mg mL -1 pentadecanoic asit (15:00) ekleyin. Bir tüp kontrol olarak sadece pentadecenoic metanol HCl asit ile tutun. Cam tüpler Teflon kaplı kapakları sıkıca kapatın.
- Inkübe gl25 dakika boyunca 80 ° C su banyosu göt tüpleri. Solvent buharlaşma olmaz böylece Tüpler mühürlü olması gerekir.
- Tüpler soğutulduktan sonra, şiddetle 1 ml hekzan ve vorteks 1 ml% 0.9 sodyum klorür ekleyin. 3 dakika için 1000xg numune santrifüjleyin.
- Davlumbaz, Pasteur pipeti ile örnek hekzan / üst tabakayı kaldırmak ve yeni bir 13x100 mm cam tüp içine yerleştirin.
- N 2 yavaş bir akışı tamamen kuruması beklenmeden altında hekzan buharlaşır.
- 60 mcL hekzan çıkan yağ açil methylesters s eritin. Örnekleri otosampler şişeleri ve kapağı sıkıca içine aktarın. Numuneler, kısa vadeli ve -20 ° C ° C bir kaç gün için 4 saklanabilir.
4. Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) 10
- GLC başlamadan önce, helyum, hidrojen ve hava tüpleri dolu olduğundan emin olun.
- Yeterli hekzan, solvent rezervuar eklendi olmalı ve atık kabını boş olmalıdır. Yağ açil methylesters ayrılması için, makineyi bir DB-23 sütun ekleyebilirsiniz.
- Otosampler yerleştirmek gözlerdir. Sistemi bilgisayar GLC ChemStation yazılımını başlatın.
- Giriş sıcaklığı 250 ° C helyum akış hızı ve 48.6 mL dak -1 21.93 psi basınç. Ayarlayın Split oranı 30.0: 1.
- Fırın sıcaklığı 140 ° C 'de 2 dakika süreyle başlangıçta ortaya konan ve 160 ° C - 25 ° C min -1 hızında kaldırdı . Ardından 160 artış sıcaklığını ayarlamak ° C ila 250 ° C hızında 8 ° C min -1 ve 250 tutun ° C - 140 azalma takip 4 dk ° C hızında 38 ° C min - 1. Bir vadede yaklaşık 21 dakika sürer.
- Alev iyonizasyon dedektör sıcaklığı 270 ° C ve hidrojen debisi 30.0 mL dak -1, hava debisi 400 mL dak -1 ve helyum debisi 30.0 mL dak -1.
- Şişeleri ve çalışma sıra tabloda örnek isimleri numarasını girin. 10 mcL enjektör, flakon başına 2 mcL örnek enjekte etmek için ayarlayın.
- Cihaz hazır olduğunda, çalışma dizisi başlatmak.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
4 haftalık Arabidopsis fide TLC ayrılmış lipitlerin geri dönüşü olmayan boyama örnekleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Sülfürik asit lekeli lipidler (Şekil 2A) kömürleşmiş ve kahverengi lekeler olarak görünür. α-naftol diğer polar lipid (Şekil 2B) sarı leke α-naftol pembe-mor bir renk taşıyan boyanmış vb Glikolipitler SQDG DGDG gibi MGDG glikolipitler leke tercih edilir. Iyot boyama geri dönüşümlüdür ve lipidler, iyot buharlaşır (Şekil 2C) gibi kısa bir zaman içinde kaybolur sarımsı bir renk verir. Lekesiz lipidler Lipidlerin yıkmak azaltmak için tercih edilir rağmen Kısaca iyot lekeli lipidler GLC analiz tabi tutulabilir.
Başarılı bir şekilde yapılırsa, farklı Yağ açil metilester temsil eden ayırt edici sinyaller (Şekil 3) GLC sonra gözlenen olacaktır. Yağ açil metilester kısa karbon zinciri ve daha az çift bağ ile DB-23 sütun kullanarak kısa tutma süresi var. Yağ açil metilester profil değişmiş lipid kompozisyonu ile mutantlar tanımlamak için hassas bir araçtır. Şekil 4'te, vahşi tip 18 ile karşılaştırıldığında tgd4-1 mutant MGDG18: 3 yağ asidi molar oranda azalmıştır. Yağ açil metilester bir lipid sınıf için tüm lipid sınıflarının mol mol bölerek, her lipid molar oranı hesaplanır. Örneğin, MGDG molar oranını hesaplamak için:
(MGDG) mol% = Σ [Fames (MGDG)] / Σ [Fames (toplam)] x100%
Yabani tip ve mutant her lipid sınıfı molar oranları mukayese edilebilir. Örneğin, tgd4-1 mutant MGDG ve PG göreceli miktarları artmış ama DGDG ve PE (Şekil 5) 18 miktarda azalma var.
Şekil 1 Arabidopsis fide kullanarak polar lipit analizi akış şeması. Toplam lipidler, 4 haftalık Arabidopsis fide çıkarılan ve TLC ayrılır . Ayrılmış lipidler GLC analizi ile takip transesterifikasyon TLC plağı kazınmış olabilir.
Şekil 2 TLC plakaları üzerinde lipitlerin ayrılması. 35 mg lipid özleri (taze ağırlık) vahşi tip fide TLC ayrılmış ve sülfürik asit (A), α-naftol (B) veya iyot buharı (C) ile boyanan. Üç tekrarlar, her boyama yöntemi gösterilmiştir. DGDG, digalactosyldiacylglycerol; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, fosfatidilkolin, PE, phosphatidylethanolamine; PG, phosphatidylglycerol; PI, fosfatidilinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol.
Şekil 3 Yağ Asitleri Methylesters GLC analizi (Fames) vahşi tip MGDG türetilmiştir. Fames 30 m kılcal sütun üzerinde ayrılır ve alev iyonizasyon tarafından tespit edilir. Pentadecanoic asit (15:00) bir iç standart olarak kullanılır.
Şekil 4 vahşi tip Süt2 (beyaz sütunlar) ve mutant tgd4-1 (siyah sütunlar) MGDG Yağ asidi profili. Yağ asitleri çift bağların sayısına göre takip karbonlar sayısı olarak sunulmaktadır. Üç tekrarlar ortalama ve standart sapmaları gösterilmiştir.
Şekil 5 vahşi tip Süt2 (beyaz sütunlar) Polar lipidler kompozisyon ve tgd4-1 mutant (siyah sütunlar). Üç tekrarlar ortalama ve standart sapmalar hata bar gösterilmiştir.
Discussion
TLC GLC ile birleştiğinde tesislerinde polar lipid kantitatif analiz için sağlam ve hızlı bir araç sağlar. Lipid bileşimi küçük değişiklikler tespit edilebilir, bu nedenle bu yöntem, polar lipid metabolik yollar 1,20 engelli mutantlar büyük ölçekli tarama için kullanılır olmuştur . Bu yöntem ayrıca, substrat olarak polar lipidler kullanan enzimler izleme faaliyetleri için yaygın olarak kullanılır . 2,6,7
Yaprakları yanı sıra, bu kök ve tohumları veya kloroplast ve mitokondri gibi hücre içi fraksiyonları gibi diğer bitki dokularının lipid kompozisyonu da aynı şekilde tespit edilebilir.
Burada kullanılan çözücü sistemi (aseton, toluen, su), bitkilerde glikolipitler ve fosfolipidlerin ayrılması için optimize edilmiştir. Ancak, tgd1, 2,3,4 mutantlar ve izole kloroplastların tetragalactosyldiacylglycerol PC ile çalışırken TGDG PE ile birlikte çalışır. Bu durumda, kloroform, metanol, asetik asit ve su (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) ile çözücü sistem 13 kullanılır . Bazen iki farklı çözücü sistemlerini kullanarak iki boyutlu TLC, daha fazla ayrı glikolipitler ve fosfolipitler 19 yapılır . Buna ek olarak, bitki dokularında doğrudan TLC 5 başlangıç ayrımı olmadan toplam yağ asidi profili belirlemek için GLC takip FAME reaksiyon tabi olabilir. Gösterdi TLC GLC sisteminin yanı sıra, lipid profili kullanılan başka bir yöntem, doğrudan elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometresi 17 dayanmaktadır . Bu yöntemde ilk kromatografik ayırma özü lipitlerin atlanır. Ancak, bu yöntem, laboratuvar veya mutant taraması için rutin analizler için daha az kullanışlı hale getirir pahalı ekipman ve deneyimli personel gerektirir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı Christoph Benning bir hibe ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-naphthol | Sigma-Aldrich | N1000 | |
| Methanolic HCL 3N | Sigma-Aldrich | 33050-U | Dilute to 1N by methanol |
| Si250-PA TLC plates | JT Baker | 7003-04 | With pre-absorbent |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z266000 | |
| Screw cap tubes | VWR international | 53283-800 | |
| Scew caps | Sun Sri | 13-425 | |
| PTFE disk | Sun Sri | 200 608 | |
| GLC system | Hewlett-Packard | HP6890 | |
| DB-23 column | J&W Scientific | 122-2332 | |
| GLC vials | Sun Sri | 500 132 | |
| Caps of GLC vials | Sun Sri | 201 828 | |
| Chemstation software | Agilent Technologies | G2070AA |
References
- Ajjawi, I. Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project. Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).
- Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope. Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).
- Awai, K. A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).
- Benning, C. Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).
- Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue. Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).
- Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1. Science. 284, 2181-2181 (1999).
- Guskov, A. Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride. 16, 334-334 (2009).
- Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).
- James, A. T., MARTIN, A. J. Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid. Biochem. J. 50, 679-679 (1952).
- Jordan, P. Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution. Nature. 411, 909-909 (2001).
- Kobayashi, K. Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation. Plant J. 57, 322-322 (2009).
- Lu, B. A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import. J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).
- Ohlrogge, J., Browse, J. Lipid biosynthesis. Plant Cell. 7, 957-957 (1995).
- Stahl, E. Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use. Pharmazie. 11, 633-633 (1956).
- Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).
- Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids. Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).
- Xu, C. Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein. Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).
- Xu, C. Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis. Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).
- Xu, C. A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis. EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).
