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दबाव नियंत्रित चूहे में गंभीर फेफड़ों की चोट प्रेरित वेंटिलेशन

Published: May 5, 2011 doi: 10.3791/2525
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Colorado

Summary

वेंटीलेटर प्रेरित फेफड़ों की चोट के लिए एक murine मॉडल एक तीव्र फेफड़ों की चोट के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है

Abstract

Murine मॉडल को बड़े पैमाने पर विभिन्न अंगों प्रणालियों (1-34) की गंभीर चोटों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है. तीव्र फेफड़ों (अली) चोट, जो लंबे समय तक यांत्रिक वेंटीलेशन के साथ होता है गंभीर बीमारी की रुग्णता और मृत्यु दर के लिए योगदान देता है, और अध्ययन उपन्यास आनुवंशिक या औषधीय लक्ष्य पर गहन जांच के क्षेत्रों (1-3, 5, 8, 26, 30, 33 -36). अली रोग है, जो गैर हृदय फेफड़े के edema और फेफड़े गैस विनिमय (36) के बाद हानि करने के लिए सुराग तीव्र शुरुआत से परिभाषित किया गया है. हम दबाव नियंत्रित वेंटिलेशन का उपयोग करने के लिए वेंटीलेटर प्रेरित फेफड़ों की चोट (2) पैदा कर अली का एक murine मॉडल विकसित किया है. इस प्रयोजन के लिए, C57BL 6 / चूहों anesthetized हैं और ट्रेकिआटमी प्रदर्शन अली के यांत्रिक वेंटीलेशन के माध्यम से शामिल द्वारा पीछा किया. 3 घंटे - चूहे दबाव नियंत्रित सेटिंग में 1 से अधिक inspiratory mbar 45 के शिखर दबाव के साथ हवादार हैं. के रूप में परिणाम पैरामीटर, फेफड़े के edema (गीला - सूखी अनुपात), bronchoalveolar द्रव albumin सामग्री, bronchoalveolar तरल पदार्थ और फेफड़े ऊतक myeloperoxidase सामग्री और फेफड़े गैस विनिमय (2) का मूल्यांकन कर रहे हैं. हम इस तकनीक का प्रयोग दिखा सकता है कि यह पर्याप्त रूप से तीव्र फेफड़ों की सूजन लाती है और विभिन्न उपचार समूहों या जीनोटाइप (5 1-3,) के बीच भेद कर सकते हैं. इसलिए इस तकनीक शोधकर्ताओं ने अली जीन लक्षित विलोपन के साथ चूहों में एक आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग में शामिल आणविक तंत्र को आगे बढ़ाने के लिए उपयोगी हो सकता है.

Protocol

जनरल टिप्पणी:

सभी आपरेशनों एक ईमानदार विदारक माइक्रोस्कोप (ओलिंप, SZX10 Z-अक्ष के साथ क्रैंक डाक STU2 स्टैंड बूम स्टैंड के साथ) के तहत और एक शल्य coagulator (11) का उपयोग करके किया जाना चाहिए. प्रयोगात्मक समूहों उम्र और वजन में संभव के रूप में के रूप में बेहतरीन मिलान किया जाना चाहिए करने के लिए परिणामों की तुलनात्मकता सुनिश्चित. तापमान, रक्तचाप, संज्ञाहरण, और तरल पदार्थ प्रशासन भर में स्थिर होना चाहिए.

1. संज्ञाहरण और ट्रेकिआ तैयारी

  1. C57BL 6 / चूहों कि कम से कम 10 सप्ताह पुरानी कर रहे हैं का उपयोग करें और जी 22-25 का एक शरीर है एक खुराक शरीर 70 मिलीग्राम / किग्रा वजन आईपी (6) पर pentobarbital सोडियम का उपयोग संज्ञाहरण प्रेरित. सोडियम मिलीग्राम / किग्रा / h pentobarbital 10 के साथ लगभग संज्ञाहरण बनाए रखें. Overdosing के बाद से इस महत्वपूर्ण रक्तचाप कम हो सकता है के साथ सावधान रहो. Pentobarbital की पुनः dosing के बाद भी प्लाज्मा स्तर में गंभीर वृद्धि करने के लिए नेतृत्व बजे कर सकते हैं.
  2. संज्ञाहरण प्रेरण, ऊपरी और निचले extremities के साथ एक टेप और टखनों को fastened सीवन का उपयोग कर कोई तालिका से जुड़ी एक लापरवाह स्थिति में सुरक्षित चूहों के बाद. दांत का उपयोग करके सिर के लिए एक ही मत करो. पर्याप्त निरोधक एक सफल इंटुबैषेण और एक अच्छी तरह से नियंत्रित सर्जरी के लिए महत्वपूर्ण है. पहले सर्जरी के लिए, खनिज तेल के साथ माउस को कवर करने के लिए माउस बाल एलर्जी के जोखिम को कम. आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए कि शरीर का तापमान स्थिर रहता है व्यावसायिक रूप से उपलब्ध खाद्य लपेटो के साथ चूहों को कवर.
  3. एक गुदा थर्मामीटर थर्मल प्रतिक्रिया नियंत्रक से जुड़ी जांच के लिए 37 पर शरीर का तापमान बनाए रखने के साथ एक तापमान नियंत्रित गरम (आरटी, Effenberg, म्यूनिख, जर्मनी) तालिका डिग्री सेल्सियस पर प्लेस चूहों
  4. शल्य चिकित्सा ट्रेकिआ बेनकाब. संयोजी ऊतक और दो 3.0 रेशम शल्य चिकित्सा (हार्वर्ड तंत्र, संयुक्त राज्य अमेरिका) सिवनी ट्रेकिआ नीचे प्रत्येक 10 सेमी लंबे जगह के ट्रेकिआ के पार्श्व और पृष्ठीय पक्षों काटना. sutures के अलावा लगभग 1 सेमी होना चाहिए.
  5. दो गोल cartilages का उपयोग कर एक McPherson Vannas कैंची (; विश्व परिशुद्धता उपकरण, संयुक्त राज्य अमेरिका 8 सेमी, सीधे ब्लेड) के बीच गला नीचे 4 मिमी - ध्यान ट्रेकिआ 3 काटकर अलग कर देना. एक खून बह रहा कारण नहीं है, के बाद से इस परिणाम मापदंडों उलझाना सकता है सुनिश्चित करें.
  6. एक tracheal कुंद पॉलीथीन cannulae (Insyte 22g, Beckton Dickinson, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग इंटुबैषेण प्रदर्शन. ट्रेकिआ में एक 85 डिग्री के कोण में पॉलीथीन cannulae की नोक डालें. फिर cannulae झुकाव है तो यह tracheal लुमेन के साथ लाइन में है. धीरे धीरे ट्यूब ट्रेकिआ नीचे आगे अग्रिम तक cannulae की नोक छाती एपर्चर में गायब हो गया है. इस स्थिति में दो शल्य चिकित्सा रेशम ट्रेकिआ (1.4 देखें) के पृष्ठीय रखा सीवन के साथ ट्यूब fixate.

2. वेंटीलेटर प्रेरित फेफड़ों की चोट की तकनीक

  1. एक वेंटीलेटर ट्यूब कनेक्ट. फेफड़ों की चोट प्रेरित करने के लिए हम सीमेंस (DRE पशु चिकित्सा, संयुक्त राज्य अमरीका) से एक सर्वो 900 सी का उपयोग करके एक दबाव नियंत्रित वेंटिलेशन तकनीक का उपयोग करें. पशु के साथ एक 2 1.0 = FiO 80 साँस / मिनट 45 mbar आवृत्ति, और mbar 0-3 की एक सकारात्मक expiratory अंत दबाव के चोटी inspiratory दबाव का उपयोग हवादार जाएगा. समाप्ति अनुपात करने के लिए प्रेरणा 1:1 होना चाहिए. तथ्य यह है कि सर्वो 900 सी मानव के लिए वेंटीलेटर के रूप में बनाया गया है के बावजूद, एक दबाव नियंत्रित वेंटीलेटर सेटिंग में इसके उपयोग के चूहों की सुनवाई के लिए उत्कृष्ट काम करता है.
  2. एक ईसीजी (उदाहरण के लिए हेवलेट पैकार्ड, बी blingen, जर्मनी) के साथ मॉनिटर दिल की दर. यकीन है कि हृदय की दर को 400 के नीचे छोड़ नहीं करता है है. एक दिल अक्ष के सही करने के लिए पाली, जब यांत्रिक वेंटीलेशन बढ़ फुफ्फुसीय धमनी intrathoracic दबाव में वृद्धि के बाद दबाव के एक संकेत के रूप में स्थापित है देखना चाहिए. यदि माउस bradycardia विकसित, तापमान और चतनाशून्य करनेवाली औषधि खुराक / एकाग्रता की जाँच करें. Xylacin / Ketamin संज्ञाहरण 250 / मिनट की एक दिल दिल लाती है और इसलिए की सिफारिश नहीं है.
  3. एक उचित तरल प्रतिस्थापन लागू. के साथ एक जलसेक सामान्य खारा 0.1 मिलीलीटर / एक धमनी या शिरापरक कैथेटर के माध्यम घंटे वेंटिलेशन के लिए पहले किया जाना चाहिए करने के लिए पर्याप्त शिरापरक दाखिल सुनिश्चित. उच्च वेंटिलेशन दबाव दिल के लिए शिरापरक वापसी बिगड़ा हुआ है, जो मतलब धमनी दबाव के एक महत्वपूर्ण ड्रॉप करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के कारण. इसके अलावा, 500 μl की एक नमकीन सांस में सर्जरी के लिए पहले आईपी दिया जा सकता है.
  4. रक्तचाप (27) की सतत रिकॉर्डिंग के लिए मन्या धमनी में एक कैथेटर रखें. शरीर को हाथ संलग्न पहले कि आप धमनी विदारक शुरू. मन्या धमनी paratracheal मांसपेशियों की कुंद विच्छेदन के माध्यम से अवगत कराया है. और अधिक जोखिम और किसी भी ऊतक आघात (vagal तंत्रिका के विशेष) सावधान परिहार के बाद, एक कैथेटर दो sutures और एक छोटे से दबाना (37) का उपयोग पोत में डाला जाता है. यह धमनी की एक लंबी खंड का खुलासा होगा. मन्या धमनी के बहुत अंत में एक संयुक्ताक्षर रखें. सीवन के अंत करने के लिए एक बड़ा दबाना संलग्न तनाव या fixate वें प्राप्त करने के लिएटेप का उपयोग कर तालिका में ई सिवनी. धमनी के आसपास एक और सिवनी प्लेस और बहुत बाहर का अंत करने के लिए धमनी काटना. यहाँ, एक छोटे से दबाना जगह है. सूक्ष्म कैंची का उपयोग करने के लिए धमनी में एक छोटे विकर्ण खोलने में कटौती. एक ठीक संदंश (Dumont, डब्ल्यूपीआई) के साथ खोलने पकड़ो और अपने हाथों / संदंश के साथ उचित आकार कैथेटर अग्रिम. अपने दूसरे सीवन के साथ एक गाँठ और धमनी सुरक्षित. क्लैंप ढीला और कैथेटर आगे अग्रिम. कई समुद्री मील और टेप के साथ कैथेटर सुरक्षित. वैकल्पिक रूप से मन्या धमनी कैथेटर जगह प्रयोग के अंत में हो रक्त गैस के विश्लेषण के लिए धमनी रक्त नमूने इकट्ठा कर सकते हैं.

3. ऊतकों के नमूनों की वसूली

यांत्रिक वेंटीलेशन के 3 घंटे के बाद, नमूने एकत्र करने के लिए फेफड़ों की चोट की हद तक का आकलन कर रहे हैं. हम brochnoalveolar lavage द्रव (बाल), धमनी रक्त और फेफड़े के ऊतकों का संग्रह सलाह देते हैं.

  1. प्रयोग के अंत में बाल तरल पदार्थ प्राप्त करते हैं. संज्ञाहरण के मजबूत बनाने के बाद, 1 मिलीलीटर फॉस्फेट के साथ tracheal ट्यूब फ्लश खारा (पीबीएस) buffered. द्रव ट्रेकिआ / फेफड़ों में तीन सेकंड के लिए रहने से पहले यह जुड़ाव सिरिंज के माध्यम से वसूली है चाहिए. BAL तस्वीर तरल नाइट्रोजन में जमे हुए है और आगे के विश्लेषण के लिए -80 ° सी में संग्रहीत. पता है कि बरामद मात्रा एक मिलीलीटर की तुलना में काफी कम किया जा सकता है.
  2. प्रयोग के अंत में रक्त गैस विश्लेषण प्रदर्शन. आदेश में करने के लिए है कि, एक चीरा उरोस्थि के नीचे सही किया जाना चाहिए. संदंश और रिब पिंजरे के साथ चीरा हद साथ उरोस्थि पकड़ो. अगला, डायाफ्राम किनारों पर छिन्न है और पसलियों से बाहर काट दिया. अब छाती के निचले एपर्चर में एक खुले दृश्य है. उरोस्थि लिफ्ट संदंश के साथ और सही और बाईं ओर पर लंबी कटौती (के रूप में संभव के रूप में पार्श्व) द्वारा छाती इतना खुला है कि पूरा पूर्वकाल छाती दीवार - वार्ड चालू है. यह किया जाना चाहिए, जबकि प्रयोगात्मक पशु अभी भी यंत्रवत् हवादार है. बाएं वेंट्रिकल 27 एक का उपयोग पंचर है आधा जी सुई और धमनियों से रक्त विश्लेषण i-स्टेट सिस्टम (Abbott, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग किया जाता है. यदि धमनियों से रक्त गैस विश्लेषण किया जाना चाहिए, एक बाल नहीं किया जा प्राप्त के बाद से इस परिणाम के लिए एक महत्वपूर्ण confounder हो जाएगा कर सकते हैं.
  3. उपरोक्त विधि के लिए वैकल्पिक रूप से, धमनियों से रक्त के नमूने मन्या धमनी कैथेटर के माध्यम से एकत्र किया जा सकता है है. हालांकि इस बाल प्राप्त करने से पहले किया जाना चाहिए.
  4. आबकारी फेफड़ों दिल खींच और ट्रेकिआ कटौती करके एन गुट. रक्त को अवशोषित करने के लिए तैयार ऊतक का एक टुकड़ा है, तो शल्य साइट दिखाई देता है. पेट की दिशा में दिल खींचो और ध्यान से रीढ़ साथ कटौती करने के लिए सभी वक्ष अंगों जुटाने. महाधमनी कट, वक्ष अंगों को हटाने और उन्हें एक साफ शल्य चिकित्सा की मेज पर जगह है.
  5. दूर दिल और ऊतक नमूने के प्रमुख पोत कट. यकीन है कि वहाँ अभी भी कोई thymus फेफड़ों से जुड़ी ऊतक है. और व्यक्तिगत ट्यूब और स्नैप - फ्रीज में कैंची जगह के साथ फेफड़ों को अलग करें. आगे के विश्लेषण के लिए -80 ° सी में स्टोर.

4. फेफड़ों की चोट के मापन

हम निम्नलिखित परिणाम पैरामीटर का उपयोग करने की अनुशंसा करने के लिए फेफड़ों की चोट की हद तक का आकलन: एक albumin (Bethyl प्रयोगशालाओं, संयुक्त राज्य अमरीका) एलिसा और प्रदर्शन (MPO myeloperoxidase) एलिसा (Hycult जैव प्रौद्योगिकी, संयुक्त राज्य अमरीका) बाधा शिथिलता की हद और सूजन की राशि का आकलन BAL द्रव में कोशिकाओं. एक MPO एलिसा प्रदर्शन भी फेफड़े के ऊतकों के रूप में. यदि गीला करने के लिए सूखी अनुपात करने के लिए मापा जा रहा है हम BAL द्रव प्राप्त नहीं करते हैं और फुफ्फुसीय संचलन (3.3 देखें) प्लावित नहीं है. छांटना के बाद फेफड़ों के वजन उपाय. तो फेफड़ों में 48 घंटे और फेफड़े के ऊतकों को फिर से मापा जाता है के लिए lyophilized हैं. फिर गीला करने के लिए सूखी अनुपात सूखी ऊतक के मिलीग्राम प्रति पानी (5) के मिलीग्राम के रूप में मापा जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. VILI चूहे के जवाब में बाल प्रोटीन सामग्री pentobarbital साथ anesthetized थे, यांत्रिक वेंटीलेशन का गठन किया गया था और चूहों दबाव नियंत्रित सेटिंग्स (45 mbar के inspiratory दबाव, सकारात्मक अंत exspiratory दबाव 3 mbar, 100 प्रेरित% का उपयोग कर हवादार थे ऑक्सीजन एकाग्रता). 0 के बाद, वेंटिलेशन बाल के 1, 2 और 3 घंटे काटा था और प्रोटीन सामग्री bicinchoninic एसिड परख (बीसीए परख) का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया था. प्रोटीन सामग्री के सापेक्ष परिवर्तन दिखाया गया है वेंटिलेशन की 0 घंटे के लिए सामान्यीकृत (n = 4 प्रति समूह, * इंगित करता है <0.05 पी नियंत्रण की तुलना में, मतलब ± SEM)

Discussion

वर्तमान अध्ययन वेंटीलेटर प्रेरित चूहों में फेफड़ों की चोट करने की एक तकनीक का वर्णन करता है. यह मॉडल उच्च दबाव वेंटिलेशन के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कारण चोट को दर्शाता है. जो चूहों में तीव्र फेफड़ों की चोट के अध्ययन पर विचार जांचकर्ता इस मॉडल से लाभ हो सकता है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd V.P.L. 9372 4mg/mL in saline
Insyte 22 G BD Biosciences n/a
Suture, silk 4.0 Harvard Apparatus 517698
Suture, Prolene 8.0 Ethicon Inc. M8739 reusable
Siemens 900°C DRE Veterinary # 336 refurbished
dissecting microscope (SZX10 ) Olympus Corporation n/a consider generous working distance
Heating Table Rt, Effenberger, Germany n/a only and single provider
Blood pressure device Cyber Sense, Inc BPM02
I STAT Abbott Laboratories n/a

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References

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