マウスにおける急性肺障害を誘発するために圧力制御された換気

Summary

人工呼吸器誘発肺障害モデルマウスは、急性肺損傷を研究する重要なツールです。

Abstract

マウスモデルは、広くさまざまな器官系（1-34）の急性損傷を調査するために使用されます。長時間の機械的な換気で発生する急性肺損傷（ALI）は、罹患率や重症疾患の死亡率に寄与し、そして新たな遺伝的または薬理学的標的に関する研究は、強烈な調査の地域（1-3、5、8、26、30、33です。 -36）。 ALIは、非心臓性肺水腫と肺ガス交換（36）のその後の障害につながる疾患、急性発症で定義されます。我々は、人工呼吸器誘発性肺障害（2）を誘導する圧力制御換気を使用してALIのマウスモデルを開発した。この目的のために、C57BL / 6マウスは麻酔し、気管切開は、機械的換気を経由してALIの誘導に続いて実行されます。 3時間 - マウスは、1で45ミリバールの吸気ピーク圧力と圧力制御の設定で換気されています。アウトカムパラメーターに、肺水腫（ウェットからドライ比）として、気管支肺胞洗浄液アルブミン含有量、気管支肺胞洗浄液および肺組織のミエロペルオキシダーゼ量と肺ガス交換は、（2）評価される。このテクニックを使用して我々はそれが十分に急性肺の炎症を誘発し、異なる治療群または遺伝子型（1-3、5）とを区別できることを示している可能性があります。したがって、この手法は、遺伝子標的欠失を有するマウスの遺伝学的アプローチを使用してALIに関与する分子機構を追求する研究者にとって役に立つ場合があります。

Protocol

総論：

すべての操作は、直立解剖顕微鏡（オリンパス、STU2スタンドブームスタンドとZ軸のクランクポストとのSZX10）の下と外科凝固剤（11）を使用して実行する必要があります。実験群は、結果の比較可能性を確保するため最善のように年齢と体重で可能な限り一致させる必要があります。温度、血圧、麻酔と輸液は終始安定している必要があります。

1。麻酔と気管の準備

1. 少なくとも10週齢C57BL / 6マウスを使用し、22から25 gのボディを持っている投与量は70mg / kg体重のIP（6）のペントバルビタールナトリウムを使用して麻酔を誘発する。約ペントバルビタール10 mg / kgの/ hのナトリウムで麻酔を維持する。これは著しく血圧を下げる可能性がありますので過剰摂取に注意する。ペントバルビタールの再投与 - であっても後の血漿中レベルの深刻な増加につながる時間は、できます。
2. 麻酔導入後に、テープと足首に固定縫合糸を使用してテーブルに取り付けられた上下肢と仰臥位での安全なマウス。歯を使って、ヘッドも同じことを行います。十分な差し止めが成功挿管とよく管理された手術のために重要です。手術前に、マウスの毛のアレルギーのリスクを減らすためにミネラルオイルを使用してマウスをカバー。体温が市販の食品包装でマウスをカバーする安定したままであることを保証するために。
3. 37℃で体温を維持するためにサーマルフィードバックコントローラに接続されている直腸温度計のプローブを用いた温度制御加熱テーブル（RT、Effenberg、ミュンヘン、ドイツ）℃の上に置いてマウス
4. 外科的気管を公開。結合組織と2つ配置3.0絹縫合糸（ハーバード装置、米国）気管の下に長い各10cmの気管の側面と背側面を詳細に分析します。縫合糸は離れて約1cmにする必要があります。
5. マクファーソン- Vannasハサミを（;世界の精密機器、アメリカ8 cmのストレート刃）使用して、2つの円形の軟骨の間に喉頭下4ミリメートル - 慎重に気管3を切開する。これは、結果パラメータを混乱させる可能性があるため、出血を引き起こすことがないことを確認してください。
6. 鈍ポリエチレンカニューレ（Insyte 22グラム、ベックトンディッキンソン、米国）を用いて気管挿管を行います。気管内に85度の角度でポリエチレンカニューレの先端を挿入します。それは気管内腔に沿っているので、その後、カニューレを傾けます。カニューレの先端が胸部の開口部で消失するまでゆっくりとさらに気管ダウンチューブを進める。気管の背側に置か2つの手術絹縫合糸でこの位置にチューブを固定（1.4参照）。

2。人工呼吸器誘発肺傷害のテクニック

1. 人工呼吸器にチューブを接続します。肺損傷を誘発するために我々は、 シーメンス （DRE獣医、米国）からサ ​​ーボ、900℃を使用することにより、圧力制御換気技術を使用してください。動物を45ミリバール、80呼吸/分とFIO ₂ = 1.0と0から3ミリバールの呼気終末陽圧の周波数の最大吸気圧を用いて換気されます。有効期限の比率にインスピレーションを1:1としてください。サーボ900℃が人間のための人工呼吸器として構築されているという事実にもかかわらず、圧力制御された人工呼吸器の設定での使用は、マウスの換気のために優秀作品。
2. ECG（例えばヒューレットパッカード、B blingen、ドイツ）と心拍数を監視します。心拍数が400以下に低下しないことを確認してください。一つは、機械的な換気が胸腔内圧の上昇に続いて増加した肺動脈圧の符号として制定されたときに、右に心臓の軸のシフトが表示されるはずです。マウスが徐脈を発症した場合、温度と麻酔用量/濃度を確認してください。 Xylacin /ケタミン麻酔は250 /分の心臓の心を誘導し、したがって、推奨されません。
3. 適切な水分補給を適用します。動脈または静脈カテーテルを介して通常の生理食塩水は0.1ml /時間で注入が十分な静脈の提出を確保するために前に換気するために実行されるべきです。平均動脈圧の重要な低下につながる可能性のある心臓への静脈還流が損なわれる高い換気圧、に起因する。また、500μlの生理食塩水ボーラスは、術前にIP提供されていました。
4. 血圧（27）の連続記録のための頸動脈にカテーテルを置きます。あなたが動脈の解剖を開始する前に本体にアームを取り付けます。頸動脈は、気管の筋肉の鈍的切開を介して公開されます。さらなる暴露とあらゆる組織の外傷（迷走神経の特定）を慎重に回避に続いて、カテーテルは、2つの縫合糸と小さなクランプ（37）を使用して容器に挿入されます。これは動脈のより長いセグメントを公開します。頸動脈の非常に最後に合字を置きます。緊張や凝視する目を取得するために縫合糸の端に大きなクランプを取り付けますテープを使用してテーブルへの電子の縫合。動脈の周囲に別の縫合糸を配置し、非常に先端部に動脈を細かく分析。ここでは、小さなクランプを配置。動脈に小さな斜めの開口部をカットするマイクロはさみを使用してください。微細な鉗子（デュモン、WPI）に開口部をホールドし、あなたの手/鉗子で適切なサイズのカテーテルを進める。 2番目の縫合糸で結び目を作り、動脈を確保する。クランプを緩め、さらにカテーテルを進める。いくつかの結び目とテープでカテーテルを固定します。また頸動脈カテーテルは、血液ガス分析のために動脈の血液サンプルを収集する実験の終端に置きますすることができます。

3。組織サンプルの回収

機械的換気の3時間後、サンプルは肺損傷の程度を評価するために収集されます。我々はbrochnoalveolar肺胞洗浄液（BAL）、動脈血および肺組織を収集することをお勧めします。

1. 実験終了時にBAL液を入手。麻酔の深化した後、1mlのリン酸と気管チューブを洗浄緩衝食塩水（PBS）。それが接続されているシリンジを介して回収される前に流体が3秒間気管/肺のままにしてください。 BALは液体窒素で瞬間凍結されているので、それ以上の分析のために-80℃で保存。回復量が1ミリリットルを大幅に下回る可能性があることに注意してください。
2. 実験終了時に血液ガス分析を行います。これを行うためには、切開は右胸骨の下になされるべきである。鉗子と範囲胸郭に沿って切開して胸骨を保持する。次に、振動板はエッジで切開し、肋骨から切り出しています。今胸部の下側開口部に開いているビューがあります。鉗子で胸骨を持ち上げて、完全な前胸部の壁が、病棟に上がっているので、右側と左側の長いカット（できるだけ横）で胸部を開きます。実験動物はまだ機械的に換気されている間にも、行われる必要があります。左心室は27を使用して穿刺さ½ G針と動脈血の分析は、i - STATシステム（アボット、米国）を使用して実行されます。動脈血ガス分析を実行する必要がある場合、これは結果に重要な交絡因子となるので、BALは、得ることができない。
3. 上記の方法に代わり、動脈血のサンプルは頸動脈カテーテルを介して収集することができます。 BALが得られる前に、しかし、この処理を行います。
4. 心を引き上げると気管を切断して消費税肺はen -ブロック。血液を吸収する準備ができて組織片を持って、手術部位が見えるように。腹部の方向に心を引いて、慎重にすべての胸部器官を動員するために背骨に沿ってカット。大動脈を切断、胸部の臓器を取り出して、きれいな手術台の上に置きます。
5. 心臓と組織サンプルの主要な血管を切り取る。まだ肺にアタッチさ胸腺組織がないことを確認してください。個々のチューブとスナップ凍結のはさみと場所によって肺を区切ります。さらなる分析のために-80 ° Cで保存。

4。肺損傷の測定

我々は、肺損傷の程度を評価するために、以下の結果のパラメータを使用することをお勧めします。バリア機能障害の程度と炎症の量を評価するためにアルブミンELISA（Bethyl研究所、米国）とミエロペルオキシダーゼ（MPO）ELISA（Hycultバイオテクノロジー、米国）を実行するBAL液中の細胞。 MPO ELISAを実行すると、肺組織を形成する。ウェットからドライ比が測定される場合に我々は、BAL液を取得していないと肺循環は、（3.3を参照）フラッシュされません。切除後に肺の重量を測定する。その後、肺は48時間凍結乾燥され、肺組織が再び測定されます。その後、ウェットからドライ比は、乾いたティッシュmg当たりの水（5）のmgで測定されます。

図1。VILI。マウスに対応してBAL中のタンパク質含有量は、ペントバルビタールで麻酔し、機械的な換気が制定され、マウスは、圧力制御の設定を（45ミリバールの吸気圧、正のエンドexspiratory圧力3ミリバール、インスピレーションを100パーセント使用して換気を行った酸素濃度）。 0、1、2、換気BALの3時間後に回収され、蛋白質含量は、ビシンコニン酸アッセイ（BCAアッセイ）を用いて定量した。タンパク質含有量の相対的な変化は換気の0時間に正規化表示されている（n = 4のグループごとに、*はp <0.05は対照と比較して示し、平均± SEM）

Discussion

本研究は、マウスの人工呼吸器誘発肺傷害を行う手法を説明します。このモデルでは、高圧の換気のために、再現性の高い傷害を示しています。マウスにおける急性肺損傷を研究する検討調査官は、このモデルの恩恵を受ける可能性があります。