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Medicine

마우스의 급성 폐 상해를 유발하는 압력 제어 환기

Published: May 5, 2011 doi: 10.3791/2525
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Colorado

Summary

환풍기 유도 폐 손상에 대한 murine 모델은 급성 폐 손상을 연구하는 중요한 도구입니다

Abstract

Murine 모델은 광범위하게 다른 장기 시스템 (1-34)의 급성 부상을 조사하는 데 사용됩니다. 장기간 기계 환기가 발생 급성 폐 손상 (ALI)는, 병적 상태 및 주요 질병의 사망률에 기여하고, 새로운 유전이나 약리 타겟에 대한 연구는 강렬한 조사 분야 (1-3, 5, 8, 26, 30, 33아르 -36). ALI가 아닌 심장 폐 부종과 폐의 가스 교환 (36)의 후속 장애로 연결이 질병의 급성 증상에 의해 정의됩니다. 우리는 환기 유발 폐 손상 (2) 유도하는 압력 제어 환기를 사용하여 ALI의 murine 모델을 개발했습니다. 이러한 목적으로, C57BL / 6 마​​우스 anesthetized 있으며 기관 절개술은 기계적 환기를 통해 ALI의 유도에 의해 다음이 수행됩니다. 삼시간 - 쥐는 1 이상 45 mbar의 inspiratory 정상 압력으로 압력 제어 설정에서 통풍이 있습니다. 결과 매개 변수, 폐 부종 (습식으로 건조 비율), bronchoalveolar 액체 알부민 콘텐츠, bronchoalveolar 유체 및 폐 조직 myeloperoxidase 컨텐츠 및 폐의 가스 교환 (2) 평가로. 이 기법을 사용 우리는 그것이 충분히 급성 폐 염증을 유도하고 다른 치료 그룹 또는 genotypes (1-3, 5)를 구분할 수있는 표시 수 있습니다. 따라서이 기법은 알리가 유전자 타겟 삭제와 생쥐에 유전자 접근법을 사용에 관련된 분자 메커니즘을 추구 연구원 도움이 될 수 있습니다.

Protocol

일반 비고 :

모든 작업은 직립 해부 현미경 (올림푸스, STU2 스탠드 붐 스탠드와 Z 축 크랭크 포스트와 SZX10) 미만 수술 coagulator (11)를 사용하여 수행되어야합니다. 실험 그룹은 결과의 comparability을 보장하기 위해 최선을 연령과 체중에 가능한 일치해야합니다. 온도, 혈압, 마취 및 유체 행정 전반에 걸쳐 안정되어야합니다.

1. 마취 및 기관 준비

  1. 적어도 10 주 된 아르 C57BL / 6 마​​우스를 사용하여 22-25 G.의 시체를 가지고 복용 70 MG / kg 체중의 IP (6)에서 pentobarbital 나트륨을 사용하여 마취를 유도. 약 pentobarbital 10 MG / kg / H 나트륨과 마취를 유지합니다. 이것은 크게 혈압을 낮출 수 있으므로 도달 했나봐로주의하십시오. pentobarbital의 다시 먹이지 - 후에도 플라즈마 수준의 심각한 증가로 이어질 시간은 - 수 있습니다.
  2. 후 마취 유도, 테이프와 발목에 고정 봉합을 사용하여 테이블에 붙어있는 위턱과 아래턱에 사지와 부정사 위치에 안전 쥐. 치아를 사용하여 머리에 대해 동일한 작업을 수행. 충분한 금지는 성공 삽관법와 잘 제어 수술 중요합니다. 이전 수술, 마우스 머리 알레르기의 위험을 줄이기 위해 광유와 마우스를 커버. 체온이 상용 식품 랩로 쥐를 커버 안정 상태를 유지하기 위해서.
  3. 37 체온을 유지하기 위해 온도 피드백 제어기에 연결된 직장 온도계 프로브와 온도 제어 온수 테이블 (RT, Effenberg, 뮌헨, 독일) ° C.에 플레이스 마우스
  4. 수술 기관을 폭로. 결합 조직 및 두 개 3.0 실크 수술 봉합 (하버드기구, 미국)기도 아래에 오랫동안 각 10cm의기도의 측면과 등의 측면을 해부하다. 봉합 떨어져 약 1cm해야합니다.
  5. 맥퍼슨 - Vannas 가위 (; 세계 정밀 계측기, 미국 8cm, 바로 블레이드) 사용하여 두 원형 연골 사이의 후두 아래에 4mm -주의기도 3 절개. 이 결과 매개 변수를 혼란시킬 수 있기 때문에, 출혈을 일으킬하지 않도록하십시오.
  6. 무딘 폴리에틸렌 캐뉼러 (Insyte 22g, 베크턴 디킨슨, 미국)를 사용 tracheal 삽관법를 수행합니다. 기관에 85도 각도에서 폴리에틸렌 캐뉼러의 끝부분을 삽입합니다. 그것은 tracheal 루멘과 일치되도록 다음 캐뉼러을 기울. 캐뉼러의 끝은 흉부의 조리개에서 사라진 때까지 천천히 더욱기도 아래 튜브를 사전. 기관 (1.4 참조) 등의 위치 두 수술 실크 봉합사이 위치에 튜브를 흥분시키는.

2. 환기 유발 폐 손상의 기술

  1. 환풍기에 튜브를 연결합니다. 폐 상해를 유발하기 위해서 우리는 지멘스 (드레 베티, 미국)에서 서보 900 C를 사용하여 압력 제어 환기 기법을 사용합니다. 동물은 FiO 2 = 1.0 피크 inspiratory 80 호흡 / 분 45 mbar, 주파수의 압력과 0-3 mbar의 긍정적인 최종 날숨 압력을 사용하여 통풍이 될 것입니다. 유효 비율 영감 1:1해야합니다. 서보 900 C는 인간에 대한 환기로 지어진이라는 사실에도 불구하고, 압력 제어 환풍기 설정에서의 사용은 생쥐의 환기를 위해 우수 작품.
  2. ECG (예 : 휴렛 팩커드, B blingen, 독일)와 모니터 심장 박동수. 심장 박동 400 아래에 드롭하지 않는지 확인하십시오. 하나는 기계적 환기가 intrathoracic 압력의 증가 이후 증가 폐동맥 압력의 기호로 제정되는 오른쪽으로 심장 축의 변화를 볼 수 있습니다. 마우스 bradycardia을 개발하면, 온도와 마취 선량 / 농도를 확인하십시오. Xylacin / Ketamin 마취 250 / 분 심장 심장을 유도하고 있으므로 권장하지 않습니다.
  3. 적절한 유체 교체를 적용합니다. 로 주입 정상적인 생리 동맥이나 정맥 카테터를 통해 ML / 시간이 충분한 정맥 제출을 보장하기 전에 통풍으로 수행되어야한다 0.1. 평균 동맥 압력의 중요한 방울로 이어질 수있는 심장 정맥 반환이 장애는 높은 환기 압력으로 인해. 또한, 500 μl의 생리 볼러스 전에 수술에 IP 부여 수 있습니다.
  4. 혈압 (27)의 지속적인 레코딩을위한 경동맥에 카테터를 삽입하십시오. 당신이 동맥을 해부 시작하기 전에 본문에 팔을 연결합니다. 경동맥은 paratracheal 근육의 무딘 절개를 통해 노출됩니다. 추가 노출 및 조직 외상 (vagal 신경의 특정)의주의 회피 후, 카테터 두 봉합과 작은 클램프 (37)를 사용하여 그릇에 삽입됩니다. 이것은 동맥의 긴 세그먼트를 노출합니다. 경동맥의 매우 끝에 묶은를 놓으십시오. 긴장하거나 흥분시키는 일을 얻기 위해 봉합의 끝에 큰 클램프를 부착테이프를 사용하여 테이블에 전자 봉합. 동맥 주위에 다른 치료를 삽입하고 아주 말초 끝에 동맥을 해부하다. 여기, 작은 클램프를 놓으십시오. 동맥에 작은 대각선 열기를 잘라 마이크로 가위를 사용합니다. 훌륭한 포셉 (뒤몽, WPI)와 개방을 잡고 손을 / 포셉와 함께 적절한 크기의 카테터를 사전. 두 번째 봉합사로 매듭을 만들어 동맥을 확보. 클램프를 풀어 더욱 카테터를 전진. 여러 노트와 테이프로 카테터를 고정합니다. 또는 경동맥 동맥 카테 테르는 혈액 가스 분석을 위해 동맥 혈액 샘플을 수집하는 실험의 끝에 장소가 될 수 있습니다.

3. 조직 샘플의 복구

기계 환기 3 시간 후, 샘플은 폐 손상의 범위를 평가하기 위해 수집하고 있습니다. 우리는 brochnoalveolar 세척 유체 (BAL), 동맥혈 및 폐 조직을 수집하는 것이 좋습니다.

  1. 실험의 끝에 BAL 액체를 얻을 수 있습니다. 마취의 심화되면 1 ML 인산과 tracheal 튜브를 플러시 호수 (PBS)를 버퍼. 그것이 연결된 주사기를 통해 회복되기 전에 액체가 3 초 동안기도 / 폐에 남아합니다. BAL은 액화 질소에 냉동 스냅인이며 자세한 분석을 위해 -80 ° C에 저장됩니다. 복구 볼륨 1 ML보다 훨씬 덜 수 있다고 알고 있습니다.
  2. 실험의 끝에 혈액 가스 분석을 수행합니다. 그렇게하기 위해서는 절개가 바로 흉골 아래하여야한다. 포셉과 정도 흉곽을 따라 절개로 가슴을 잡아. 다음 횡경막은 가장자리에 베인이며 갈비에서 도려 있습니다. 이제 흉부의 하단 구멍에 열려있는 전망이있다. 포셉과 흉골을 들어서 전체 앞쪽에 흉부 벽이 - 워드를 설정되어 있도록 오른쪽 왼쪽에 긴 상처 (가능한 측면)의 흉부를 엽니다. 실험 동물이 여전히 기계적 통풍있는 동안 이것은, 완료해야합니다. 좌심실은 27을 사용하여 구멍을 것입니다 ½ G 바늘과 동맥혈 분석은 I - STAT 시스템 (애보트, 미국)를 사용하여 수행됩니다. 동맥혈 가스 분석이 수행되어야하는 경우이 결과에 상당한 confounder되기 때문에, BAL은 얻을 수 없습니다.
  3. 또는 위의 방법으로, 동맥 혈액 샘플은 경동맥 동맥 카테터를 통해 수집하실 수 있습니다. BAL가 취득되기 전에 그러나이 완료되어야합니다.
  4. 마음을 끄는하고기도를 잘라하여 엑사이스 폐 엉 - 블록. 혈액을 흡수하기 위해 준비 조직의 조각을 가지고 수술 사이트가 표시되도록. 복부의 방향으로 마음을 당겨 조심스럽게 모든 흉부 장기를 동원하기 위해 척추 따라 절개해. 대동맥을 잘라 흉부 장기를 제거하고 깨끗한 수술 테이블에 그들을 놓으십시오.
  5. 심장과 조직 샘플의 주요 혈관을 버려야. 여전히 폐에 연결된 어떤 thymus 조직이 없다는 것을 확인하십시오. 개인 튜브 및 스냅인 동결에 가위와 장소 폐​​ 구분합니다. 자세한 분석을 위해 -80 ° C에 보관하십시오.

4. 폐 손상의 측정

저희는 폐 손상의 범위를 평가하기 위해 다음과 같은 결과 매개 변수를 사용하는 것이 좋습니다 : 알부민 엘리사 (Bethyl 연구소, 미국)와 장벽 장애의 범위와 염증의 양을 평가하는 myeloperoxidase (MPO) 엘리사를 (Hycult 생명 공학, 미국) 수행 BAL 유체의 세포. MPO 엘리사를 수행하면 폐 조직을 형성합니다. 서부 유럽 표준시 - 투 - 드라이 비율 측정하는 경우 우리는 BAL 액체를 얻을하지 않으며 폐동맥 순환이 (3.3 참조) 플러시되지 않습니다. 절단 후 폐의 무게를 측정합니다. 그러면 폐에은 48 H 및 폐 조직이 다시 측정을 위해 동결 건조된 있습니다. 그런 다음 젖은 대 건조 비율은 건조 조직의 MG 당 물 (5)의 MG로 측정됩니다.

그림 1
그림 1. 빌리. 마우스에 대한 응답으로 BAL의 단백질 내용 pentobarbital로 anesthetized 있었다, 기계적 환기가 제정과 생쥐는 압력 제어 설정 (45 mbar의 inspiratory 압력, 긍정적인 최종 exspiratory 압력 3 mbar, 영감을 백퍼센트 사용하고 통풍이되었습니다 산소 농도). 0 후에는 환기 BAL의 1, 2, 3 시간은 수확되었고 단백질 내용은 bicinchoninic 산성 검정 (BCA 분석)를 사용하여 계량되었습니다. 단백질 내용의 상대적인 변화가 환기 0 시간 표준 표시됩니다 (n은 = 4 그룹 당, *는 P <0.05 제어할 비교 표시, ± SEM을 의미)

Discussion

현재의 연구는 생쥐에서 환기 유발 폐 손상을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 고압 환기에 의한 높은 재현성 부상을 보여줍니다. 생쥐의 급성 - 폐 상해를 공부 고려 수사관이 모델에서 혜택을 누릴 수 있습니다.

Disclosures

우리는 공개 없어요.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd V.P.L. 9372 4mg/mL in saline
Insyte 22 G BD Biosciences n/a
Suture, silk 4.0 Harvard Apparatus 517698
Suture, Prolene 8.0 Ethicon Inc. M8739 reusable
Siemens 900°C DRE Veterinary # 336 refurbished
dissecting microscope (SZX10 ) Olympus Corporation n/a consider generous working distance
Heating Table Rt, Effenberger, Germany n/a only and single provider
Blood pressure device Cyber Sense, Inc BPM02
I STAT Abbott Laboratories n/a

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