Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Давление контролируемой вентиляции, чтобы вызвать острого повреждения легких у мышей

Published: May 5, 2011 doi: 10.3791/2525
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Colorado

Summary

Мышиной модели вентилятора индуцированного повреждения легких является важным инструментом для изучения острого повреждения легких

Abstract

Мышиной модели широко используются для исследования острой травмы различных систем органов (1-34). Острого повреждения легких (ALI), который возникает при длительной искусственной вентиляции легких, способствует заболеваемости и смертности от критических заболеваний, а также исследования по роману генетические или фармакологические цели областях интенсивных исследований (1-3, 5, 8, 26, 30, 33 -36). АЛИ определяется острое начало заболевания, что приводит к не-сердечной отек легких и последующие нарушения легочного газообмена (36). Мы разработали мышиной модели АЛИ с помощью давления контролируемой вентиляции, чтобы побудить вентилятор-индуцированного повреждения легких (2). Для этой цели C57BL / 6 мышей наркоз и трахеотомия производится следуют индукции АЛИ помощью механической вентиляции. Мыши в вентилируемом давления контролируемой обстановке с вдоха пиковое давление 45 мбар в течение 1 - 3 часа. Как результат параметров, отек легких (мокрого на сухой отношение), бронхоальвеолярного жидкости альбумина содержания, бронхоальвеолярного жидкости и легочной содержание миелопероксидазы ткани и газообмена в легких оцениваются (2). Используя эту технику мы могли бы показать, что она достаточно вызывает острое воспаление легких и может различать между различными группами лечения или генотипами (1-3, 5). Поэтому эта методика может быть полезной для исследователей, которые преследуют молекулярные механизмы, вовлеченные в АЛИ использованием генетического подхода у мышей с геном целевого удаления.

Protocol

Общие замечания:

Все операции должны проводиться в вертикальном рассекает микроскоп (Olympus, SZX10 с Z-Axis Crank Сообщение с STU2 Стенд Boom Stand) и с помощью хирургического коагулятора (11). Экспериментальных групп должны соответствовать как можно лучше по возрасту и весу для обеспечения сопоставимости результатов. Температура, давление крови, анестезии и жидкости администрации должно быть стабильным во всем.

1. Анестезия и трахеи подготовки

  1. Используйте C57BL / 6 мышей, которые, по крайней мере 10 недель и тела 22-25 г. Вызвать анестезии применяют натрия фенобарбитала в дозе 70 мг / кг массы тела в ф (6). Поддержание анестезии примерно по 10 мг / кг / ч натрия фенобарбитала. Будьте осторожны с передозировкой, так как это может привести к значительному снижению кровяного давления. Re-дозирование фенобарбитала - даже после часов, может привести к серьезному увеличению плазменных уровней.
  2. После анестезии индукции, безопасный мышей в лежачем положении с верхних и нижних конечностей придается таблице с помощью ленты и шовный крепятся к лодыжкам. Сделайте то же самое для головы с помощью зубов. Достаточное сдерживающим важно для успешной интубации и хорошо контролируемых операций. Перед операцией, накрыть мышь с минеральным маслом, чтобы уменьшить риск аллергии мыши волос. Для того, чтобы убедиться, что температура тела остается стабильной покрытие мышей с коммерчески доступной пищи пленкой.
  3. Место на мышах с контролируемой температурой подогревом таблицы (РТ, Effenberg, Мюнхен, Германия) с ректальный зонд термометра придается тепловой контроллер обратной связи для поддержания температуры тела при температуре 37 ° C.
  4. Expose трахеи хирургическим путем. Рассеките боковой и спинной сторон трахеи соединительной ткани и поместите два 3,0 шелк хирургический шов (Harvard аппарата, США), каждый длиной 10 см под трахеи. Швы должны быть примерно 1 см друг от друга.
  5. Аккуратно надрезать трахеи 3 - 4 мм ниже гортани между двумя круговыми хрящей использованием Макферсон-Vannas Ножницы (8 см, прямым лезвием; инструменты Всемирного Precision, США). Убедитесь в том, чтобы не вызвать кровотечения, так как это может посрамить результат параметров.
  6. Выполните интубации трахеи при помощи тупого полиэтиленовых канюль (Insyte 22g, Бектон Дикинсон, США). Вставьте кончик полиэтиленовых канюль в 85 градусов в трахею. Затем наклон канюли так что в соответствии с трахеи просвет. Медленно трубку дальше трахеи до кончика канюли исчез в грудной клетке отверстие. Зафиксируйте трубки в этом положении с двух хирургических шовных шелк помещен спинной трахеи (см. п. 1.4).

2. Техника вентилятор-индуцированного повреждения легких

  1. Подключите трубку к искусственной вентиляции легких. Чтобы вызвать повреждения легких мы используем метод давления контролируемой вентиляции с помощью сервопривода 900 С от Siemens (DRE ветеринарный, США). Животные будут вентилируемые использованием пик вдоха давление 45 мбар, частотой 80 вдохов / мин и положительного давления в конце выдоха в 0-3 мбар с FiO 2 = 1,0. Вдохновение с истечением соотношение должно быть 1:1. Несмотря на то, что Servo 900 C построен как вентилятор для человека, его использование в контролируемых условиях давления вентилятор работает отлично для вентиляции мышей.
  2. Монитор сердечного ритма и ЭКГ (например, Hewlett Packard, B blingen, Германия). Убедитесь, что частота сердечных сокращений не опускается ниже 400. Надо видеть смещение оси сердца вправо, при механической вентиляции возбуждено как признак повышенного давления легочной артерии после увеличения внутригрудного давления. Если мышь развивается брадикардия, проверьте температуру и дозы анестезии / концентрации. Xylacin / кетамин анестезии побуждает сердце сердце 250 / мин, и поэтому не рекомендуется.
  3. Применение надлежащего замены жидкости. Инфузии с физиологическим раствором 0,1 мл / час через артериальный или венозный катетер должен быть проведен в вентиляцию, чтобы обеспечить достаточную подачу вен. Из-за высоких давлений вентиляции венозный возврат к сердцу нарушается, что может привести к критической капли среднего артериального давления. Кроме того, солевой болюс 500 мкл может быть предоставлена ​​ф до операции.
  4. Место катетер в сонную артерию для непрерывной записи артериального давления (27). Приложите руку к телу, прежде чем начать рассекает артерии. Сонной артерии подвергается помощью тупого рассечения паратрахеальных мышц. После дальнейшего воздействия и тщательно избегать любых тканей травма (особенно из блуждающего нерва), катетер вводится в сосуд с помощью двух швов и небольшой зажим (37). Это позволит выставить больше сегменте артерии. Место лигатуры на самом конце сонной артерии. Приложить больше зажима до конца шва для получения напряжения или фиксировать йэлектронной шва к столу с помощью липкой ленты. Место другого шва вокруг артерии и артерии рассекают до самого дистального конца. Здесь, место небольшой зажим. Использование микро-ножницы, чтобы вырезать небольшую диагональ открытия в артерию. Держите открытия с прекрасно щипцы (Дюмон, WPI) и заранее надлежащего размера катетер с руки / щипцами. Сделайте узел с вашего второго шва и безопасной артерии. Ослабьте хомут и продвигать катетер дальше. Безопасные катетер с несколькими узлами и лентой. Кроме сонную артерию катетер может быть места в конце эксперимента, чтобы собирать образцы артериальной крови для анализа крови газа.

3. Восстановление образцов тканей

Через 3 часа механической вентиляции, образцы собираются, чтобы оценить степень повреждения легких. Мы рекомендуем собирать brochnoalveolar жидкости лаважа (БАЛ), артериальной крови и легочной ткани.

  1. Получить БАЛ в конце эксперимента. После углубления анестезии, флеш трахеи трубкой с 1 мл фосфатно-солевым буфером (PBS). Жидкость должна оставаться в трахею / легких в течение трех секунд, прежде чем восстановление с помощью подключенного шприц. BAL является оснастки замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 ° C для дальнейшего анализа. Имейте в виду, что восстановленные объем может быть значительно меньше, чем 1 мл.
  2. Выполнить анализ газового состава крови в конце эксперимента. Для того, чтобы сделать это, разрез должен быть сделан прямо под грудиной. Держите грудины пинцетом и степени надрез вдоль грудной клетки. Далее, диафрагма надрезанные по краям и вырезается из ребер. Теперь есть открытый вид в нижней апертурой грудной клетки. Поднимите грудины с пинцетом и открытой грудной клетки длинные разрезы в правой и левой стороны (как боковые, насколько возможно), так что полный передней стенки грудной клетки оказался-подопечных. Это должно быть сделано, в то время экспериментальных животных до сих пор искусственной вентиляции легких. Левого желудочка проколот использованием 27 ½ G иглы и артериальной анализ крови проводится с использованием я-СТАТ системы (Abbott, США). Если артериальное анализа газов крови должен быть выполнен, БАЛ не может быть получено, так как это будет значительным confounder к результатам.
  3. В качестве альтернативы методу выше, артериальная образцы крови могут быть собраны через сонную артерию катетер. Однако это должно быть сделано до БАЛ получается.
  4. Акцизный легких ан-блока, потянув за сердце и перерезать трахею. Есть кусочек ткани готовы поглощать крови, поэтому хирургическое сайт видимым. Вытяните сердца в направлении живота и аккуратно надрезать вдоль позвоночника к мобилизации всех органов грудной клетки. Вырезать аорты, удалить органов грудной клетки и разместить их на чистый операционный стол.
  5. Срежьте сердца и основных судно образец ткани. Убедитесь, что нет тимус ткани еще привязаны к легких. Отдельные легких с ножницами и место в отдельных трубок и оснастки замерзнуть. Хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего анализа.

4. Измерение повреждения легких

Мы рекомендуем использовать следующие параметры результат для оценки степени повреждения легких: Выполнение альбумина ELISA (Bethyl Laboratories, США) и миелопероксидазы (МПО) ELISA (Hycult биотехнологии, США) с целью оценки степени барьерной дисфункции и количество воспалительных клеток в жидкости БАЛ. Выполните МРО ELISA также форма легочной ткани. Если мокрого на сухой соотношение для измерения мы не получим БАЛ и малый круг кровообращения не покраснел (см. п. 3.3). Мера веса легких после иссечения. Затем легкие лиофилизированный в течение 48 ч и легочной ткани снова измеряется. Затем мокрого на сухой соотношение измеряется в мг воды в мг сухой ткани (5).

Рисунок 1
Рисунок 1. Содержание белка в БАЛ в ответ на Вили. Мышей наркозом с фенобарбиталом, механическая вентиляция была учреждена и мышей вентилируемых с помощью давления контролируемые параметры (давление вдоха на 45 мбар, положительный конечный exspiratory давление 3 мбар, 100% вдохновил Концентрация кислорода). После 0, 1, 2 и 3 часов в режиме вентиляции БАЛ был собран и содержание белка было количественно, используя bicinchoninic анализа кислоты (ДСС анализ). Относительное изменение содержания белка показана нормированная на 0 часов вентиляции (п = 4 в каждой группе, * обозначает р <0,05 по сравнению с контролем, в среднем ± SEM)

Discussion

Данное исследование описывает технику выполнения вентилятор-индуцированного повреждения легких у мышей. Эта модель демонстрирует высокой воспроизводимостью травмы из-за высокого давления вентиляции. Следователи, которые считают изучение острой повреждения легких у мышей, могут извлечь выгоду из этой модели.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd V.P.L. 9372 4mg/mL in saline
Insyte 22 G BD Biosciences n/a
Suture, silk 4.0 Harvard Apparatus 517698
Suture, Prolene 8.0 Ethicon Inc. M8739 reusable
Siemens 900°C DRE Veterinary # 336 refurbished
dissecting microscope (SZX10 ) Olympus Corporation n/a consider generous working distance
Heating Table Rt, Effenberger, Germany n/a only and single provider
Blood pressure device Cyber Sense, Inc BPM02
I STAT Abbott Laboratories n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eckle, T., Faigle, M., Grenz, A., Laucher, S., Thompson, L. F., Eltzschig, H. K. A2B adenosine receptor dampens hypoxia-induced vascular leak. Blood. 111, 2024-2035 (2008).
  2. Eckle, T., Fullbier, L. G. renz, A,, Eltzschig, H. K. Usefulness of pressure-controlled ventilation at high inspiratory pressures to induce acute lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 718-724 (2008).
  3. Eckle, T., Fullbier, L., Wehrmann, M., Khoury, J., Mittelbronn, M., Ibla, J., Rosenberger, P., Eltzschig, H. K. Identification of ectonucleotidases CD39 and CD73 in innate protection during acute lung injury. J Immunol. 178, 8127-8137 (2007).
  4. Eckle, T., Grenz, A., Kohler, D., Redel, A., Falk, M., Rolauffs, B., Osswald, H., Kehl, F., Eltzschig, H. K. Systematic evaluation of a novel model for cardiac ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, 2533-2540 (2006).
  5. Eckle, T., Grenz, A., Laucher, S., Eltzschig, H. K. A2B adenosine receptor signaling attenuates acute lung injury by enhancing alveolar fluid clearance in mice. J Clin Invest. 118, 3301-3315 (2008).
  6. Eckle, T., Krahn, T., Grenz, A., Kohler, D., Mittelbronn, M., Ledent, C., Jacobson, M. A., Osswald, H., Thompson, L. F., Unertl, K., Eltzschig, H. K. Cardioprotection by ecto-5'-nucleotidase (CD73) and A2B adenosine receptors. Circulation. 115, 1581-1590 (2007).
  7. Eltzschig, H. K. Adenosine: an old drug newly discovered. Anesthesiology. 111, 904-915 (2009).
  8. Eltzschig, H. K., Eckle, T., Mager, A., Kuper, N., Karcher, C., Weissmuller, T., Boengler, K., Schulz, R., Robson, S. C., Colgan, S. P. ATP release from activated neutrophils occurs via connexin 43 and modulates adenosine-dependent endothelial cell function. Circ Res. 99, 1100-1108 (2006).
  9. Eltzschig, H. K., Ibla, J. C., Furuta, G. T., Leonard, M. O., Jacobson, K. A., Enjyoji, K., Robson, S. C., Colgan, S. P. Coordinated adenine nucleotide phosphohydrolysis and nucleoside signaling in posthypoxic endothelium: role of ectonucleotidases and adenosine A2B receptors. J Exp Med. 198, 783-796 (2003).
  10. Eltzschig, H. K., Kohler, D., Eckle, T., Kong, T., Robson, S. C., Colgan, S. P. Central role of Sp1-regulated CD39 in hypoxia/ischemia protection. Blood. 113, 224-232 (2009).
  11. Frick, J. S., MacManus, C. F., Scully, M., Glover, L. E., Eltzschig, H. K., Colgan, S. P. Contribution of adenosine A2B receptors to inflammatory parameters of experimental colitis. J Immunol. 182, 4957-4964 (2009).
  12. Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H., Huang, D. Y., Wehrmann, M., Kohle, C., Unertl, K., Osswald, H., Eltzschig, H. K. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 475-485 (2007).
  13. Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T., Yang, D., Zhang, H., Tran, Z. V., Klingel, K., Ravid, K., Eltzschig, H. K. The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia. PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).
  14. Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T., Mittelbronn, M., Wehrmann, M., Kohle, C., Kloor, D., Thompson, L. F., Osswald, H., Eltzschig, H. K. Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia. J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).
  15. Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M., Eckle, T., Klingel, K., Huang, D. Y., Muller, C. E., Robson, S. C., Osswald, H., Eltzschig, H. K. Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).
  16. Grenz, A., Zhang, H., Weingart, J., von Wietersheim, S., Eckle, T., Schnermann, J. B., Kohle, C., Kloor, D., Gleiter, C. H., Vallon, V., Eltzschig, H. K., Osswald, H. Lack of effect of extracellular adenosine generation and signalling on renal erythropoietin secretion during hypoxia. Am J Physiol Renal Physiol. , (2007).
  17. Haeberle, H. A., Durrstein, C., Rosenberger, P., Hosakote, Y. M., Kuhlicke, J., Kempf, V. A., Garofalo, R. P., Eltzschig, H. K. Oxygen-independent stabilization of hypoxia inducible factor (HIF)-1 during RSV infection. PLoS ONE. 3, e3352-e3352 (2008).
  18. Hart, M. L., Gorzolla, I. C., Schittenhelm, J., Robson, S. C., Eltzschig, H. K. SP1-dependent induction of CD39 facilitates hepatic ischemic preconditioning. J Immunol. 184, 4017-4024 (2010).
  19. Hart, M. L., Henn, M., Kohler, D., Kloor, D., Mittelbronn, M., Gorzolla, I. C., Stahl, G. L., Eltzschig, H. K. Role of extracellular nucleotide phosphohydrolysis in intestinal ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 22, 2784-2797 (2008).
  20. Hart, M. L., Jacobi, B., Schittenhelm, J., Henn, M., Eltzschig, H. K. Cutting Edge: A2B Adenosine receptor signaling provides potent protection during intestinal ischemia/reperfusion injury. J Immunol. 182, 3965-3968 (2009).
  21. Hart, M. L., Kohler, D., Eckle, T., Kloor, D., Stahl, G. L., Eltzschig, H. K. Direct treatment of mouse or human blood with soluble 5'-nucleotidase inhibits platelet aggregation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, 1477-1483 (2008).
  22. Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C., Schittenhelm, J., Kloor, D., Stahl, G. L., Eltzschig, H. K. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
  23. Hart, M. L., Much, C., Kohler, D., Schittenhelm, J., Gorzolla, I. C., Stahl, G. L., Eltzschig, H. K. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
  24. Hartmann, H., Eltzschig, H. K., Wurz, H., Hantke, K., Rakin, A., Yazdi, A. S., Matteoli, G., Bohn, E., Autenrieth, I. B., Karhausen, J., Neumann, D., Colgan, S. P., Kempf, V. A. Hypoxia-independent activation of HIF-1 by enterobacteriaceae and their siderophores. Gastroenterology. 134, 756-767 (2008).
  25. Heinzelmann, F., Jendrossek, V., Lauber, K., Nowak, K., Eldh, T., Boras, R., Handrick, R., Henkel, M., Martin, C., Uhlig, S., Kohler, D., Eltzschig, H. K., Wehrmann, M., Budach, W., Belka, C. Irradiation-induced pneumonitis mediated by the CD95/CD95-ligand system. J Natl Cancer Inst. 98, 1248-1251 (2006).
  26. Koeppen, M., Eckle, T., Eltzschig, H. K. Selective deletion of the A1 adenosine receptor abolishes heart-rate slowing effects of intravascular adenosine in vivo. PLoS One. 4, e6784-e6784 (2009).
  27. Kohler, D., Eckle, T., Faigle, M., Grenz, A., Mittelbronn, M., Laucher, S., Hart, M. L., Robson, S. C., Muller, C. E., Eltzschig, H. K. CD39/ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 provides myocardial protection during cardiac ischemia/reperfusion injury. Circulation. 116, 1784-1794 (2007).
  28. Kuhlicke, J., Frick, J. S., Morote-Garcia, J. C., Rosenberger, P., Eltzschig, H. K. Hypoxia Inducible Factor (HIF)-1 Coordinates Induction of Toll-Like Receptors TLR2 and TLR6 during Hypoxia. PLoS ONE. 2, e1364-e1364 (2007).
  29. Morote-Garcia, J. C., Rosenberger, P., Kuhlicke, J., Eltzschig, H. K. HIF-1-dependent repression of adenosine kinase attenuates hypoxia-induced vascular leak. Blood. 111, 5571-5580 (2008).
  30. Morote-Garcia, J. C., Rosenberger, P., Nivillac, N. M., Coe, I. R., Eltzschig, H. K. Hypoxia-inducible factor-dependent repression of equilibrative nucleoside transporter 2 attenuates mucosal inflammation during intestinal hypoxia. Gastroenterology. 136, 607-618 (2009).
  31. Reutershan, J., Vollmer, I., Stark, S., Wagner, R., Ngamsri, K. C., Eltzschig, H. K. Adenosine and inflammation: CD39 and CD73 are critical mediators in LPS-induced PMN trafficking into the lungs. FASEB J. 23, 473-482 (2009).
  32. Schingnitz, U., Hartmann, K., Macmanus, C. F., Eckle, T., Zug, S., Colgan, S. P., Eltzschig, H. K. Signaling through the A2B adenosine receptor dampens endotoxin-induced acute lung injury. J Immunol. 184, 5271-5279 (2010).
  33. Thompson, L. F., Eltzschig, H. K., Ibla, J. C., Van De Wiele, C. J., Resta, R., Morote-Garcia, J. C., Colgan, S. P. Crucial role for ecto-5'-nucleotidase (CD73) in vascular leakage during hypoxia. J. Exp. Med. 200, 1395-1405 (2004).
  34. Aherne, C. M., Kewley, E. M., Eltzschig, H. K. The resurgence of A2B adenosine receptor signaling. Biochim Biophys Acta. , (2010).
  35. Eckle, T., Koeppen, M., Eltzschig, H. K. Role of extracellular adenosine in acute lung injury. Physiology (Bethesda). 24, 298-306 (2009).
  36. Koeppen, M., Feil, R., Siegl, D., Feil, S., Hofmann, F., Pohl, U., de Wit, C. cGMP-dependent protein kinase mediates NO- but not acetylcholine-induced dilations in resistance vessels in vivo. Hypertension. 44, 952-955 (2004).

Tags

Медицина выпуск 51 вентилятор-индуцированного повреждения легких острого повреждения легких целевой ген удаления мышиной модели легких
Давление контролируемой вентиляции, чтобы вызвать острого повреждения легких у мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koeppen, M., Eckle, T., Eltzschig,… More

Koeppen, M., Eckle, T., Eltzschig, H. K. Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice. J. Vis. Exp. (51), e2525, doi:10.3791/2525 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter