Tryckstyrd ventilation för att framkalla akut lungskada hos möss

Summary

En mus-modell för respirator inducerad lungskada är ett viktigt verktyg för att studera en akut lungskada

Abstract

Musmodeller används flitigt för att undersöka akuta skador av olika organ system (1-34). Akut lungskada (ALI), vilket sker med långvarig mekanisk ventilation, bidrar till sjuklighet och dödlighet av allvarlig sjukdom, och studier om nya genetiska eller farmakologiska mål är områden med intensiv utredning 1-3 (, 5, 8, 26, 30, 33 -36). ALI definieras av akut sjukdom, vilket leder till icke-kardiell lungödem och efterföljande nedskrivning av pulmonell gasutbyte (36). Vi har utvecklat en mus modell av ALI med hjälp av en tryck-kontrollerad ventilation för att förmå ventilator-inducerad lungskada (2). För detta ändamål C57BL / 6 möss är bedövad och en trakeotomi utförs följt av induktion av ALI via mekanisk ventilation. Möss är ventilerade i en tryck-kontrollerad miljö med en inspiratorisk topp tryck på 45 mbar över 1 - 3 timmar. Som resultatet parametrar, lungödem (vått till torrt ratio), bronkoalveolär vätska albumin innehåll bronkoalveolär vätska och lungvävnad myeloperoxidas innehåll och pulmonell gasutbyte bedöms (2). Med denna teknik kunde vi visa att det är tillräckligt inducerar akut lunginflammation och kan skilja mellan olika behandlingsgrupperna eller genotyper (1-3, 5). Därför denna teknik kan vara till hjälp för forskare som bedriver molekylära mekanismer som är inblandade i ALI med en genetisk strategi i möss med genen riktade radering.

Protocol

Allmänna anmärkningar:

All verksamhet ska ske under en upprätt dissekera mikroskop (Olympus, SZX10 med Z-Axis Crank-post STU2 Stand Boom Stand) och genom att använda en kirurgisk coagulator (11). Den experimentella grupper bör matchas så bra som möjligt i ålder och vikt för att garantera jämförbarhet av resultaten. Temperatur, blodtryck, anestesi-och vätsketillförsel bör vara stabila under.

1. Anestesi och luftstrupen förberedelse

1. Använd C57BL / 6 möss som är minst 10 veckor gammal och har en kropp av 22-25 g. Inducera anestesi med natrium pentobarbital vid en dos 70 mg / kg kroppsvikt ip (6). Upprätthålla anestesi ungefär med 10 mg / kg / timme natrium pentobarbital. Var försiktig med att överdosera eftersom detta påtagligt kan sänka blodtrycket. Re-dosering av pentobarbital - även efter timmar-kan leda till allvarliga ökningar i plasmanivåerna.
2. Efter anestesi induktion, säker möss i ryggläge med övre och nedre extremiteterna fäst vid bordet med hjälp av en tejp och en sutur fäst till anklarna. Gör samma sak för huvudet med hjälp av tänderna. Tillräckligt besöksförbud är viktigt för en lyckad intubering och en väl kontrollerad kirurgi. Före operation, täck musen med mineralolja för att minska risken för musen hår allergi. För att säkerställa att kroppstemperaturen förblir stabil täcka möss med kommersiellt tillgängliga mat wrap.
3. Placera möss på en temperatur-kontrollerad uppvärmd tabellen (RT, Effenberg, München, Tyskland) med en rektal termometer sond fäst termisk återföring controller för att upprätthålla kroppstemperaturen vid 37 ° C.
4. Exponera luftstrupen kirurgiskt. Dissekera laterala och dorsala sidan av luftstrupen av bindväv och placera två 3,0 siden kirurgiska suturer (Harvard apparater, USA) var 10 cm lång under luftstrupen. Stygnen ska vara ca 1 cm mellanrum.
5. Försiktigt incise luftstrupen 3 - 4 mm nedanför struphuvudet mellan två cirkulära brosk med hjälp av en McPherson-Vannas Scissors (8 cm, rakt blad, World precisionsinstrument, USA). Se till att inte orsaka en blödning, eftersom det kan förbrylla resultatet parametrar.
6. Utför en intubation med ett trubbigt polyeten kanyler (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Sätt spetsen av polyeten kanyler i en 85 graders vinkel ner i luftstrupen. Sedan luta kanyler så det är i linje med trakeal lumen. Sakta förväg röret längre ner i luftstrupen tills spetsen kanyler har försvunnit i bröstkorgen bländare. Fixera röret i detta läge med två kirurgiska siden sutur placeras rygg av luftstrupe (se 1,4).

2. Teknik för ventilator-inducerad lungskada

1. Anslut röret till en respirator. Att inducera lungskada vi använder en tryckstyrd ventilation teknik med hjälp av en Servo 900 C från Siemens (DRE veterinär, USA). Djur kommer att ventileras med hjälp av topp inspiratoriska tryck på 45 mbar, frekvens av 80 andetag / min och ett positivt slut expiratoriskt tryck på 0-3 mbar med en FiO ₂ = 1,0. Inspirationen till utgångsdatum förhållandet skall vara 1:1. Trots det faktum att Servo 900 C är byggd som fläkt för människor, arbetar dess användning i en tryckstyrd respirator inställning utmärkt för ventilation av möss.
2. Pulsmätare med ett EKG (t.ex. Hewlett Packard, B blingen, Tyskland). Se till att pulsen inte sjunker under 400. Man bör se en förskjutning av hjärtat axeln till höger, när mekanisk ventilation inleds som ett tecken på ökad lungartären tryck efter en ökning intratorakalt tryck. Om musen utvecklar bradykardi, kontrollera temperatur och narkos dos / koncentration. Xylacin / Ketamin anestesi framkallar ett hjärta mitt i 250 / min och rekommenderas därför inte.
3. Applicera en lämplig vätskeersättning. En infusion med fysiologisk koksaltlösning 0,1 ml / timme via en arteriell eller venkateter bör utföras före ventilation för att säkerställa tillräcklig venös arkivering. På grund av den höga ventilationen tryck på venöst återflöde till hjärtat är nedsatt, vilket kan leda till en kritisk droppe av genomsnittligt blodtryck. Dessutom kan en saltlösning bolusdos på 500 l ges ip före operation.
4. Placera en kateter i halspulsådern för kontinuerlig registrering av blodtryck (27). Fäst armen mot kroppen innan du börjar dissekera artären. Halspulsådern exponeras via dissektion av paratracheal muskler. Efter ytterligare exponering och noggrann undvikande av vävnad trauma (särskilt vagusnerven) är en kateter sätts in i fartyget med hjälp av två suturer och en liten klämma (37). Detta kommer att utsätta en längre segment av artären. Placera en ligatur i slutet av halspulsådern. Bifoga en större klämma till slutet av sutur för att få spänning eller fixera the sutur till bordet med tejp. Ställ ytterligare ett sutur runt artär och dissekera artären till den mycket distala änden. Här, placera en liten klämma. Använd mikro sax för att klippa en liten diagonal öppning in i artären. Håll öppningen med en fin pincett (Dumont, WPI) och avancera rätt storlek katetern med händerna / pincett. Gör en knut med din andra sutur och säkra artären. Lossa klämman och avancera katetern ytterligare. Säkra katetern med flera knutar och tejp. Alternativt halspulsådern katetern kan i slutet av försöket att samla arteriella blodprov för blodgas analys.

3. Återvinning av vävnadsprover

Efter 3 timmar av mekanisk ventilation, tas blodprov för att bedöma omfattningen av lungskada. Vi rekommenderar att samla brochnoalveolar lavage (BAL), arteriellt blod och lungvävnad.

1. Skaffa BAL vätska i slutet av experimentet. Efter fördjupningen av anestesi, spola trakealtub med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Vätskan bör förbli i luftstrupen / lungorna under tre sekunder innan den återhämtning via den anslutna sprutan. BAL är snap-frysta i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C för vidare analys. Var medveten om att den återvunna volymen kan vara betydligt mindre än 1 ml.
2. Utför analys blodgas vid slutet av experimentet. För att göra det, bör ett snitt göras precis under bröstbenet. Håll bröstbenet med pincett och omfattning snittet längs bröstkorgen. Därefter är membranet inristade i kanterna och skärs ut från revbenen. Nu finns det en öppen utsikt i nedre öppning av bröstkorgen. Lyft bröstbenet upp med pincett och öppna bröstkorgen av långa snitt på höger och vänster sida (så sidled som möjligt) så att hela främre bröstkorgen väggen slås uppåt. Detta bör göras samtidigt som försöksdjur fortfarande är mekaniskt ventilerad. Vänster kammare punkteras med hjälp av en 27 ½ G-nål och arteriella blod analyser utförs med hjälp av i-STAT System (Abbott, USA). Om arteriella blodgas analys bör göras, kan en BAL inte kan erhållas, eftersom detta kommer att bli en betydande confounder till resultaten.
3. Som alternativ till metoden ovan kan arteriella blodprover tas via halspulsådern kateter. Men detta bör göras innan BAL erhålls.
4. Excise lungorna sv-bloc genom att dra upp hjärtat och skär i luftstrupen. Har en bit vävnad redo att absorbera blod, så operationsområdet är synlig. Dra hjärtat i riktning mot buken och fräs försiktigt längs med ryggraden att mobilisera alla bröstkorg organ. Klipp aorta, ta bort bröstkorg organ och placera dem på en ren kirurgisk bord.
5. Klipp bort hjärtat och de stora fartyget av vävnadsprov. Se till att det inte finns någon bräss vävnad fortfarande sitter i lungorna. Separera lungorna med en sax och placera i enskilda rör och snap-frysa. Förvaras vid -80 ° C för vidare analys.

4. Mätning av lungskada

Vi rekommenderar att du använder följande resultat parametrar för att bedöma omfattningen av lungskada: Genomför en albumin ELISA (Bethyl Laboratories, USA) och en myeloperoxidas (MPO) ELISA (Hycult Bioteknik, USA) för att bedöma omfattningen av hinder dysfunktion och mängden av inflammatoriska celler i BAL vätska. Gör en MPO ELISA också ligger till lungvävnad. Om våta till torra förhållande skall mätas får vi inte BAL vätska och lungkretsloppet inte spolas (se 3.3). Mät vikt lungorna efter excision. Sedan lungor frystorkat för 48 h och lungvävnad igen mäts. Sedan den våta till torra förhållande mäts i mg vatten per mg torr trasa (5).

Figur 1. Proteininnehållet i BAL som svar på Vili. Möss var bedövas med pentobarbital var mekanisk ventilation inrättades och möss ventileras med hjälp av tryck-inställningar (inspiratoriska tryck på 45 mbar, positiv slutet exspiratory tryck 3 mbar, 100% inspirerad syrehalt). Efter 0, var 1, 2 och 3 timmar av ventilation BAL skördas och proteinhalten var kvantifieras med hjälp av en bicinchoninic syra analys (BCA test). Den relativa förändringen av proteinhalten visas normaliserad till 0 timmar ventilation (n = 4 per grupp, tyder * p <0,05 jämfört med kontroll, genomsnitt ± SEM)

Discussion

Den aktuella studien beskriver en teknik att utföra ventilator-inducerad lungskada hos möss. Denna modell visar mycket reproducerbar skada på grund av högt tryck ventilation. Utredarna som anser att studera akut-lungskada hos möss kan ha nytta av denna modell.