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L'uso di un sistema di peso per appendere l'occlusione dell'arteria coronarica nei topi

Published: April 19, 2011 doi: 10.3791/2526
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver

Summary

Un modello murino di ischemia miocardica e precondizionamento ischemico è un importante strumento di studio dei meccanismi cardioprotettivi

Abstract

Studi murini di danno acuto rappresentano un campo di indagine intensa, come i topi knockout per i geni differenti sono sempre più disponibili 1-38. Cardioprotezione di precondizionamento ischemico (PI) rimane un settore di ricerca intensa. Per chiarire ulteriormente la sua base molecolare, l'utilizzo degli studi di topo knockout è particolarmente importante 7, 14, 30, 39. Nonostante il fatto che studi precedenti hanno già eseguito con successo ischemia cardiaca e riperfusione nei topi, questo modello è tecnicamente molto impegnativo. In particolare, l'identificazione visiva delle arterie coronarie, il posizionamento della sutura intorno alla nave e occlusione coronarica legando al largo la nave con un nodo supportato è tecnicamente difficile. Inoltre, riaprendo il nodo di riperfusione intermittente dell'arteria coronaria durante IP senza provocare traumi chirurgici aggiunge ulteriore sfida. Inoltre, se il nodo non è legato giù abbastanza forte, riperfusione involontaria a causa di occlusione imperfetta della coronaria possono influenzare i risultati. In realtà, questo può facilmente verificarsi a causa del movimento del cuore che batte.

Sulla base di potenziali problemi associati all'uso di un sistema di nodi occlusione coronarica, abbiamo adottato un modello precedentemente pubblicato di cardiomiopatia cronica basata su un sistema di pesi appesi intermittente per occlusione coronarica durante IP 39. In realtà, occlusione coronarica può quindi essere raggiunto senza dover occludere il coronarica da un nodo. Inoltre, la riperfusione del vaso può essere facilmente raggiunto sostenendo i pesi appesi che sono in una localizzazione remota dai tessuti cardiaci.

Abbiamo testato questo sistema in modo sistematico, tra cui variazione dei tempi di ischemia e riperfusione, precondizionamento reggimenti, la temperatura corporea e il substrato genetico 39. Oltre alla colorazione infarto, abbiamo testato la troponina cardiaca I (cTnI) come marker di infarto miocardico in questo modello. In realtà, i livelli plasmatici di cTnI correlata con le dimensioni dell'infarto (R2 = 0,8). Infine, possiamo mostrare in diversi studi che questa tecnica produce dimensioni dell'infarto altamente riproducibili nel corso del PI murini e infarto miocardico, 6, 8, 30, 40, 41. Pertanto, questa tecnica può essere utile per i ricercatori che perseguono meccanismi molecolari coinvolti nella cardioprotezione da IP utilizzando un approccio genetico nei topi con delezione genica mirata. Ulteriori studi su IP cardiaco utilizzando topi transgenici può prendere in considerazione questa tecnica.

Protocol

Osservazioni generali:

Tutte le operazioni devono essere effettuate con un microscopio verticale dissezione (Olympus, SZX10 con Z-Axis Messaggio Crank con STU2 stand StandBoom) e utilizzando un coagulatore chirurgico. La ventilazione è fondamentale per la procedura e quindi una certa quantità di tempo dovrebbe essere speso per la scelta del ventilatore e ottimizzare la tecnica di ventilazione. Temperatura, pressione sanguigna e l'anestesia dovrebbe essere stabile per tutto.

1. Anestesia, intubazione e monitoraggio

  1. Usa C57BL / 6 topi che sono almeno 10 settimane. Indurre l'anestesia con pentobarbital sodico alla dose di 70 mg / kg di peso corporeo ip mantenere l'anestesia con circa 10 mg / kg / h di sodio pentobarbital. Siate cauti con sovradosaggio poiché questo potrebbe ridurre significativamente la pressione sanguigna. Ri-somministrazione di pentobarbital - anche dopo ore, può portare ad un aumento dei livelli plasmatici gravi. Sulla base di una forte evidenza per quanto riguarda l'isoflurano come composto cardioprotettivo si consiglia l'uso del 'inerte' e ben consolidata pentobarbital in un modello di ischemia miocardica 46-56.
  2. Topi svolge su un tavolo a temperatura controllata riscaldata (RT, Effenberg, Monaco, Germania) con una sonda termometro rettale collegata al controller feedback termico per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C.
  3. Dopo i topi induzione dell'anestesia sicuro in posizione supina, con le estremità superiore e inferiore fissato al tavolo con un nastro e una sutura fissato alle caviglie. Fare lo stesso per la testa usando i denti. Un contenimento sufficiente è importante per una intubazione di successo e chirurgia ben controllato. Prima dell'intervento, coprire il mouse con olio minerale per ridurre il rischio di allergia del mouse capelli.
  4. Esporre la trachea chirurgicamente ed eseguire l'intubazione tracheale con cannule bluntpolyethylene (Insyte 22g, Beckton Dickinson, USA). Si dovrà smussato l'ago per essere in grado di usarlo come uno stiletto.
  5. Tirare la linguetta con l'ausilio di una pinza e quindi spingere delicatamente in un angolo di 15 gradi verso il corpo. Anche dopo l'esposizione della trachea e l'utilizzo di un microscopio, questo potrebbe richiedere un certo addestramento. Essere consapevoli che un piccolo danno della trachea potrebbe comportare l'impossibilità di ventilare l'animale per tutta la sutura. Quindi, in caso di problemi delle vie aeree controllare la trachea per piccoli fori.
  6. Confermare il corretto posizionamento del tubo per la visualizzazione diretta della cannula nella trachea precedentemente esposti al di sopra della carena.
  7. Collegare il tubo di un ventilatore. Si consiglia una tecnica di ventilazione controllata a pressione utilizzando un Servo 900 C da Siemens (DRE Veterinaria, USA). Gli animali saranno poi ventilare con picco di pressione inspiratoria di 10 mbar, la frequenza di 110 respiri / min e una positiva di fine espirazione pressione di 3-5 mbar con una FiO 2 = 0,4. Impostazioni potrebbe essere necessario qualche aggiustamento che può essere raggiunto più facilmente controllando i polmoni durante l'intervento chirurgico torace aperto. Assicurarsi che i polmoni non sono crollate o troppo lunghi. Nonostante il fatto che il Servo 900 C è costruito come ventilatore per l'uomo, il suo utilizzo in un ambiente controllato ventilatore a pressione eccellenti opere per la ventilazione dei topi.
  8. Effettuare analisi dei gas del sangue per confermare normale scambio di gas (pressione parziale di ossigeno, PaO 2 di 115 ± 15 mmHg e pressione parziale di anidride carbonica, Paco 2 di 38 ± 6 mmHg) dopo 4 a 6 ore di tempo la ventilazione usando la i-STAT System (Abbott, USA).
  9. Monitor della frequenza cardiaca con un elettrocardiogramma (ad esempio Hewlett Packard, Böblingen, Germania). Assicurarsi che la frequenza cardiaca non scende sotto i 450. Se il mouse si sviluppa bradicardia controllare la temperatura e la dose di anestetico / concentrazione. Xylacin / Ketamin anestesia induce un cuore cuore di 250 / min e non è pertanto raccomandato.
  10. Applicare una sostituzione adeguata di liquidi. Un infuso con soluzione salina normale 0,1 ml / ora tramite un catetere arterioso o venoso deve essere eseguito prima della comparsa di ischemia. Inoltre, il bolo di soluzione fisiologica di 500 microlitri potrebbe essere dato ip prima dell'intervento. Thoractomy può indurre un calo della pressione sanguigna e può richiedere ulteriori Boli salina. Dopo ischemia, una velocità di infusione fino a 1 ml / ora può essere necessario per mantenere una pressione arteriosa media sopra i 60 mmHg e di garantire una riperfusione critica sufficiente per la colorazione infarto utilizzando TTC.
  11. Inserire una arteria carotidea (PE10, Tip OD (mm / "), conici> 0,024 mm/.011") per la registrazione continua della pressione sanguigna. L'arteria carotide saranno esposti tramite dissezione dei muscoli paratracheali. A seguito di evitare ulteriore esposizione e attento di qualsiasi trauma dei tessuti (in particolare del nervo vagale), un catetere viene inserito nel vaso con due punti di sutura e una pinza di piccole dimensioni. Fissare il braccio al corpo prima di iniziare la dissezione dell'arteria. Questo esporrà un pezzo più lungo l'arteria. Nodo alla fine della parte prossimale della carotide. Fissare una pinza più grande per la fine della sutura aottenere la tensione. Posto un altro sutura intorno all'arteria e sezionare l'arteria fino alla fine distale. Qui, posto una fascetta di piccole dimensioni. Usare le forbici per tagliare micro una piccola apertura in diagonale l'arteria. Tenere l'apertura con una pinza sottile (Dumont, WPI) e far avanzare il catetere di dimensione corretta, con le mani / pinze. Fare un nodo con il tuo sutura secondo e sicuro l'arteria. Allentare il morsetto e far avanzare il catetere ulteriormente. Fissare il catetere con parecchi nodi e nastro.

2. Tecnica di occlusione dell'arteria coronarica

  1. Sezionare la pelle ed esporre la parete sinistra del torace con una tecnica smussato dissezione.
  2. Tagliare il muscoli pettorali major e minori per esporre la parete toracica con una cauterizzazione. Tirando la grande pettorale, il polmone gocce, così una pinza da elettrobisturi può essere inserito, e, 1-3 mm al di sopra del polmone, una linea orizzontale che attraversano gli strappi dovrebbe essere coagulato.
  3. Usando una forbice smussato, tagliare la parete toracica. Spille di sicurezza modificate, se viene rimossa la piastra di cattura e alla fine smussata è piegato, vengono poi utilizzati per mantenere il torace aperto.
  4. Per facilitare il posizionamento finale della sutura, coagulare e tagliare la parete toracica lungo la membrana verso il lato in basso a sinistra del torace.
  5. Esporre il cuore dalla dissezione del pericardio. Per evitare i movimenti del diaframma togliere e tagliare il nervo frenico.
  6. Utilizzare un bastoncino di cotone bagnato con una pinza e ruotare il cuore verso il lato destro. Identificare la coronaria sinistra (LCA) e fare in modo che i polmoni non sono troppo inflazionato. Ottimizzare l'apertura del torace per avere una presa sicura del cuore quando si posiziona la sutura. Se la pressione sanguigna è troppo bassa l'identificazione potrebbe essere complicato. Boli aggiuntivi di soluzione salina potrebbe migliorare l'identificazione del LCA. La LCA è una nave di colore rosso vivo che attraversano il cuore in senso orizzontale (in contrasto con le vene di ritorno). A volte, il LCA si vede meglio senza un microscopio. Non usare troppo molta luce. Questo può portare a recidere i riflessi rendendo impossibile la visualizzazione.
  7. Una volta che il LCA è visivamente identificato, mettere un 8,0 sutura in nylon (Prolene, Ethicon, Notiefies, USA) in tutto il LCA. Ai fini del LCA occlusione intermittente, abbiamo adottato un modello di cardiomiopatia cronica 42 utilizzando un sistema di pesi appesi.
  8. Far passare la sutura attraverso un piccolo pezzo di tubo di plastica (PE-10 tubi) con spigoli smussati e allegare due piccoli pesi (1g, ad esempio, utilizzare provette Eppendorf riempito d'acqua) per ogni estremità. Con i pesi liberamente appeso sopra un bastone, l'LCA deve essere immediatamente occluso. Inoltre, quando il peso è sollevato, LCA occlusione è terminato in una volta. Successo LCA occlusione deve essere confermata da un immediato cambiamento di colore della nave dalla luce rossa a viola scuro, il cambiamento di colore del miocardio fornito dalla nave (dal rosso acceso al bianco) e la presenza di ST-aumenti l'ECG. Durante la riperfusione, i cambiamenti di colore istantaneamente scompare. Tenere il cuore bagnato con un 37 ° C, soluzione salina bagnato, pezzo di cotone idrofilo in tutto (vedi anche Figura 1).
  9. Ha scelto il tempo di ischemia, secondo il suo interesse primario. Infatti, per gli studi di effetti cardioprotettivi degli IP, l'ideale sarebbe utilizzare un tempo di ischemia associato ad un infarto nelle dimensioni di circa 30 al 40% della AAR. Così, sarebbe possibile dimostrare i cambiamenti in entrambe le direzioni, ad esempio piccole dimensioni infarto con IP cardiaca o infarto grandi dimensioni con un terapeutico sperimentale o di una delezione del gene specifico. Inoltre, i topi con una dimensione di infarto inferiore al 50% di solito sopravvivono all'esperimento, mentre dimensioni infarto da 60 a 80% spesso non sono sopravvissuti e gli animali muoiono prima del tempo di riperfusione è completa. Utilizzando il nostro modello di 10 minuti di ischemia miocardica seguito da 2 ore di riperfusione risultato in una dimensione infartuale di 3,5 ± 1,3% della AAR. Al contrario, un tempo di ischemia di 60 minuti consente di ottenere una dimensione infartuale media di 42 ± 5,2% del AAR (p <0.01) 39. Quindi, consideriamo un 60 minuti di ischemia come ideale per studiare i cambiamenti in entrambe le direzioni. Tuttavia, potrebbe essere necessario regolare il tempo di ischemia nei topi genica mirata con un fenotipo sever.
  10. Ha scelto il momento giusto riperfusione. Il tempo di riperfusione è di fondamentale importanza per la colorazione TTC. Il colorante incolore si riduce ad un rosso mattone color precipitato deidrogenasi in presenza del coenzima NADH. Cellule morenti perdono la loro capacità di trattenere NADH e, quindi, si delineano come aree all'interno del rosso pallido macchiato miocardio vitale. Dimensione infartuale delineazione di TTC richiede che NADH è stata lavata completamente dalla zona necrotica. Tuttavia, se la riperfusione non è abbastanza lungo, delineazione dimensione infartuale dalla colorazione TTC può causare una sottostima della dimensione dell'infarto reali 43. Nelle nostre mani, dopo un tempo di ischemia di 60 min, la misurazione della dimensione dell'infarto è aumentato da 11,5 ± 4,5% dopo 30 minuti al 42,2 ± 5,1%dopo 120 minuti. Nessun ulteriore aumento della dimensione infartuale poteva essere individuato con tempi di riperfusione più lunghi (240 minuti) 39. Quindi, si consiglia un periodo di 2 ore di riperfusione, che sembra anche ragionevole nel contesto di determination.If enzimi cardiaci si considera ischemia precondizionamento, si consiglia di 4 cicli di IP (5 min di ischemia, riperfusione 5 min), seguita da un momento ischemia di 60 min e un tempo di 2 ore di riperfusione. In queste condizioni, l'IP è stato associato con un 3.2 volte la riduzione della dimensione dell'infarto dal 42,2 ± 5,1% al 13,3 ± 3,3% del AAR 39. Tuttavia, a causa del sistema di pesi appesi, diversi reggimenti precondizionamento potrebbe facilmente essere applicato.

3. Determinazione della zona a rischio (AAR) e dimensioni dell'infarto miocardico

Dopo l'induzione di un infarto del miocardio (con o senza IP), la zona è perfuso dal LCA (area a rischio, AAR) e la dimensione dell'infarto stesso sarà determinato utilizzando una tecnica di colorazione. Successivamente, infarto sarà calcolato come percentuale di infarto miocardico rispetto al AAR. Per fare questo, una tecnica precedentemente descritta doppia colorazione con il cloruro di blu e trifeniltetrazolio Evan (TTC) è usato 44.

  1. Determinare la relazione annuale di attività per iniezione retrograda di 1% colorante blu di Evan in aorta, mentre il LCA è occluso. In alternativa, se un catetere carotis è a posto, utilizzare questo percorso per l'iniezione blu di Evans. Evans blu si macchia tutto blu del tessuto miocardico, ad eccezione del AAR. E 'fondamentale per questo passaggio per evitare bolle d'aria all'interno del catetere, come sarebbero iniettato nella circolazione coronarica e prevenire colorazione blu di Evan. Prima della colorazione blu di Evans si potrebbe desiderare di raccogliere il sangue per la misurazione degli enzimi cardiaci. In aggiunta, la rimozione di sangue, iniettando 5 ml di soluzione fisiologica attraverso un catetere aortica o carotis è raccomandato.
  2. Accise il cuore e lavare in soluzione salina ghiacciata 0,9%
  3. Incorpora in agarosio al 2%. Non utilizzare calda agarosio poiché questo impedirà colorazione successo.
  4. Dopo 30 minuti a +4 ° C (o 15 minuti -20 ° C), tagliare il cuore a fette di 1 mm utilizzando una matrice di cuore o microtomo. Se si posiziona il cuore in freezer evitare il congelamento a secco che porterà a cuore non macchiato.
  5. Incubare le fette con l'1% TTC a 37 ° C per 10 minuti con un berretto blu 15 ml in un bagno d'acqua. Questo permetterà la zona infartuata essere delimitata come zona bianca, mentre le macchie di tessuto vitale rosso.
  6. Fissare le fette colorate con il 10% fomaldehyde durante la notte. In questo modo, la zona infartuata è meglio contrastata migliorare la qualità delle immagini.
  7. Determinare l'area a rischio (AAR) e la dimensione infartuale tramite planimetria utilizzando il software NIH Image 1,0 45.
  8. Calcolare la percentuale di miocardio infartuato dalla zona a rischio.

4. Enzima di misurazione cardiaca

A causa di limitazioni associate con colorazione TTC si consiglia la lettura come strumenti in più per la gravità dell'infarto del miocardio la determinazione della troponina cardiaca I (cTnI) i livelli nel siero di topi. Il sangue viene prelevato dalla vena portale ed i livelli sierici di cTnI sono poi determinate con un quantitativo test rapido cTnI (Vita Diagnostics, Inc., West Chester, PA, USA).

5. Rappresentante dei risultati:

Figura 1
Figura 1. (A) Modello di IP cardiaco con un peso appeso sistema di occlusione coronarica. Questa tecnica non richiede un nodo per occlusione coronarica. (B, C) l'installazione chirurgica. (D) Immagine di un cuore murino con la coronaria sinistra (LCA, frecce) dopo l'occlusione. Identificazione visiva del LCA è necessario per la legatura e precondizionamento ischemico nei topi. Un 8,0 sutura in nylon è collocato intorno al millimetro LCA 1-2 sotto l'atrio sinistro. La sutura è threaded attraverso un piccolo tubo di plastica (*). La fine di ogni sutura è collegato a un piccolo peso (1g) e la sutura è posta sopra aste su entrambi i lati. (E) Determinazione della AAR dopo LCA occlusione e iniezione retrograda di colorante blu di Evan nell'aorta. L'AAR rimane senza macchia, mentre il resto del miocardio è blu. Dopo l'incubazione del tessuto AAR con TTC, il macchiato dell'area infartuata bianco, mentre il tessuto vitale rosso macchiato.

Discussion

Il presente studio descrive una nuova tecnica di esecuzione IP in un modello murino intatto con una sospensione di peso del sistema, e quindi evitando l'occlusione coronarica da un nodo. In realtà, questo studio dimostra dimensioni dell'infarto altamente riproducibili e la protezione cardiaca da IP, riducendo al minimo la variabilità associata a nodi basati su modelli occlusione coronarica. Gli investigatori che considerano gli studi cardioprotezione da IP nei topi possono trarre beneficio da questo modello.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Gli studi attuali sono supportati dal National Heart, Lung, and Blood Institute di Grant HL0921-R01, R01-R01-DK083385 e HL098294 a HK Eltzschig, il 1K08HL102267-01 a T. Eckle e Fondazione per l'educazione Anestesia e borse di ricerca a T. Eckle e HK Eltzschig e American Heart Association Grant a T. Eckle e HK Eltzschig e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) borsa di studio di ricerca a M. Koeppen. Ringraziamo Shelley Eltzschig per l'opera d'arte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd V.P.L. 9372 4mg/mL in saline
TTC Sigma-Aldrich 17779 Fluka 1.5 % in PBS
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129 10g in 1 L PBS
Insyte 22 G BD Biosciences n/a
Suture, silk 4.0 Harvard Apparatus 517698
Suture, Prolene 8.0 Ethicon Inc. M8739 reusable
Heart Matrix Zivic Instruments # HSMS001
Siemens 900 C DRE Veterinary # 336 refurbished
dissecting microscope (SZX10 ) Olympus Corporation n/a consider generous working distance
Heating Table Rt, Effenberger, Germany n/a only and single provider
Blood pressure device Cyber Sense, Inc BPM02
I STAT Abbott Laboratories n/a

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