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Medicine

Uso de um Sistema de Peso de suspensão para oclusão da artéria coronária em ratos

Published: April 19, 2011 doi: 10.3791/2526
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver

Summary

Um modelo murino de isquemia miocárdica e pré-condicionamento isquêmico é uma importante ferramenta de estudo de mecanismos cardioprotetores

Abstract

Estudos murino de lesão aguda são uma área de intensa investigação, como camundongos knockout para os genes diferentes estão se tornando cada vez mais disponíveis 1-38. Cardioproteção por pré-condicionamento isquêmico (PI) continua sendo uma área de intensa investigação. Para melhor elucidar a sua base molecular, o uso de estudos com ratos knockout é particularmente importante 7, 14, 30, 39. Apesar do fato de que estudos anteriores já realizados com sucesso isquemia cardíaca e reperfusão em ratos, este modelo é tecnicamente muito difícil. Particularmente, a identificação visual da artéria coronária, a colocação da sutura ao redor do navio e oclusão coronária por amarrar a embarcação com um nó suportado é tecnicamente difícil. Além disso, re-abertura do nó de reperfusão intermitente da artéria coronária durante IP sem causar trauma cirúrgico acrescenta desafio adicional. Além disso, se o nó não está amarrado forte reperfusão, o suficiente acidental devido a oclusão imperfeita da coronária podem afetar os resultados. Na verdade, isso pode facilmente ocorrer devido ao movimento do batimento cardíaco.

Com base em potenciais problemas associados ao uso de um sistema de oclusão coronária atado, adotamos um modelo previamente publicados de cardiomiopatia crônica baseada em um sistema de peso pendurado por oclusão da artéria coronária intermitente durante 39 IP. Na verdade, a oclusão da artéria coronária pode assim ser alcançado sem a necessidade de ocluir a coronária por um nó. Além disso, a reperfusão do vaso pode ser facilmente conseguida através do apoio dos pesos que são pendurados em uma localização remota a partir de tecidos cardíacos.

Nós testamos este sistema de forma sistemática, incluindo variação de isquemia e reperfusão vezes, regimentos pré-condicionamento, a temperatura do corpo e base genética 39. Além de infarto coloração, testamos troponina I (cTnI) como um marcador de infarto do miocárdio neste modelo. Na verdade, os níveis plasmáticos de cTnI correlacionados com tamanhos de infarto (R2 = 0,8). Finalmente, nós poderíamos mostrar em vários estudos que esta técnica produz tamanhos infarto altamente reprodutível durante IP murino e infarto do miocárdio 6, 8, 30, 40, 41. Portanto, essa técnica pode ser útil para pesquisadores que buscam mecanismos moleculares envolvidos na cardioproteção por IP usando uma abordagem genética em camundongos com deleção do gene alvo. Mais estudos sobre IP cardíaca utilizando camundongos transgênicos podem considerar esta técnica.

Protocol

Observações gerais:

Todas as operações devem ser realizadas em um microscópio de dissecação vertical (Olympus, SZX10 com Z-Axis Mensagem Crank com STU2 Fique StandBoom) e usando um coagulador cirúrgico. Ventilação é fundamental para o processo e, portanto, uma certa quantidade de tempo deve ser gasto na escolha do ventilador e otimizando a técnica de ventilação. Temperatura, pressão arterial e anestesia deve ser estável por toda parte.

1. Intubação anestesia e monitoramento

  1. Use camundongos C57BL / 6 que são pelo menos 10 semanas de idade. Induzir a anestesia com pentobarbital sódico na dose de um ip 70 mg / kg peso corporal manter a anestesia com aproximadamente 10 mg / kg / h de sódio pentobarbital. Seja cauteloso com overdose uma vez que este pode reduzir significativamente a pressão arterial. Re-dose de pentobarbital - mesmo depois de horas-pode levar a um aumento severo dos níveis plasmáticos. Com base em fortes evidências sobre isoflurano como composto cardioprotetor recomendamos o uso do "inerte" e bem estabelecidos pentobarbital em um modelo de isquemia miocárdica 46-56.
  2. Camundongos colocar em uma mesa aquecida com temperatura controlada (RT, Effenberg, Munique, Alemanha) com uma sonda termômetro retal ligado ao controlador de retorno térmico para manter a temperatura corporal a 37 ° C.
  3. Depois de ratos indução anestésica segura em posição supina, com as extremidades superiores e inferiores em anexo a tabela com uma fita e uma sutura presa aos tornozelos. Faça o mesmo para a cabeça, usando os dentes. A restrição suficiente é importante para uma intubação e cirurgia bem sucedida bem controlada. Antes da cirurgia, cobrir o mouse com óleo mineral para reduzir o risco de alergia cabelo mouse.
  4. Expor a traquéia cirurgicamente e realizar uma intubação traqueal utilizando cânulas bluntpolyethylene (INSYTE 22g, Beckton Dickinson, EUA). Você terá que blunt a agulha para ser capaz de usá-lo como um estilete.
  5. Puxe a língua para fora usando um par de fórceps e empurre delicadamente em um ângulo de 15 graus em direção ao corpo. Mesmo após a exposição da traquéia e usando um microscópio, isto pode exigir algum treinamento. Estar ciente de que um dano pequeno da traquéia pode levar à incapacidade de ventilar o animal ao longo da sutura. Assim, se você encontrar problemas das vias aéreas verificar a traquéia de pequenos buracos.
  6. Confirmar o posicionamento correto através da visualização direta da cânula dentro da traquéia anteriormente expostos acima da carina.
  7. Ligue o tubo a um ventilador. Recomendamos uma pressão técnica de ventilação controlada usando um C 900 Servo da Siemens (DRE Veterinária, EUA). Animais serão então ventilado com pressão inspiratória de pico de 10 mbar, frequência de 110 respirações / min e uma pressão positiva expiratória final de 3-5 mbar com uma FiO 2 = 0,4. Configurações pode precisar de alguns ajustes que podem ser alcançados mais facilmente, verificando os pulmões durante a cirurgia do tórax aberto. Certifique-se que os pulmões não são recolhidos ou overextended. Apesar do fato de que o C 900 Servo é construído como ventilador para os seres humanos, a sua utilização em um ambiente de ventilação pressão controlada excelentes trabalhos para a ventilação de camundongos.
  8. Realizar a análise de gás de sangue para confirmar a troca gasosa normal (pressão parcial de oxigênio, PaO 2 de 115 ± 15 mmHg e pressão parcial de dióxido de carbono, paCO 2 de 38 ± 6 mmHg) após 4 a 6 horas de tempo de ventilação usando o i-STAT sistema (Abbott, EUA).
  9. Monitor de freqüência cardíaca com ECG (por exemplo, Hewlett Packard, Böblingen, Alemanha). Certifique-se que a freqüência cardíaca não cai abaixo de 450. Se o rato se desenvolve bradicardia verificação da temperatura e da dose do anestésico / concentração. Xylacin / cetamina induz anestesia um coração coração de 250 / min e não é recomendada.
  10. Aplique uma reposição de líquidos adequada. Uma infusão com solução salina 0,1 ml / hora através de um cateter arterial ou venosa deve ser realizada antes do início da isquemia. Além disso, uma solução salina em bolus de 500 mL pode ser dado ip antes da cirurgia. Thoractomy pode induzir uma queda na pressão sanguínea e pode exigir boli solução salina. Após a isquemia, uma taxa de perfusão até 1 ml / hora pode ser necessário para manter uma pressão arterial média acima de 60 mmHg e garantir uma reperfusão crítica suficiente para a coloração de infarto utilizando TTC.
  11. Coloque uma artéria carótida (PI10, Tip OD (mm / "), cônicos> 0,024 mm/.011") para a gravação contínua da pressão arterial. A artéria carótida serão expostos por meio de dissecção romba da musculatura paratraqueal. Após a exposição ainda mais cuidado e evitar de qualquer trauma tecidual (particular do nervo vago), um cateter é inserido dentro do vaso usando duas suturas e uma pinça pequena. Fixe o braço para o corpo antes de começar a dissecção da artéria. Isto irá expor um pedaço mais longo da artéria. Knot terminar a muito da parte proximal da artéria carótida. Anexar um maior aperto para o final da sutura paraobter tensão. Coloque outro sutura ao redor da artéria e dissecar a artéria até o fim distal. Aqui, colocar uma braçadeira de pequeno porte. Use uma tesoura para cortar micro de uma pequena abertura na diagonal dentro da artéria. Segure a abertura com uma pinça fina (Dumont, WPI) e avançar o cateter de tamanho apropriado com as mãos / fórceps. Faça um nó com o seu segundo e segura de sutura da artéria. Solte a braçadeira e avançar o cateter ainda mais. Fixe o cateter com vários nós e fita.

2. Técnica de oclusão da artéria coronária

  1. Dissecar a pele e expor a parede do tórax esquerdo, utilizando uma técnica de dissecção romba.
  2. Corte dos músculos peitorais maiores e menores para expor a parede do tórax com um cautério. Ao puxar o peitoral maior, o de pulmão cai, assim, uma pinça a partir da unidade eletrocirúrgica podem ser inseridos, e, 1-3 mm acima do pulmão, uma linha horizontal cruzando os rasgos devem ser coagulado.
  3. Usando uma tesoura embotado, corte a parede do tórax. Alfinetes de segurança modificado, onde a placa de captura é removida ea extremidade sem corte é dobrado, são então utilizados para manter o tórax aberto.
  4. Para facilitar a colocação final da sutura, coagular e cortar a parede do tórax ao longo do diafragma para o lado inferior esquerdo do tórax.
  5. Exposição do coração através da dissecção do pericárdio. Para evitar movimentos do diafragma remover e cortar o nervo frênico.
  6. Use uma vara pequena de algodão molhado com uma pinça e converterá o coração para o lado direito. Identificar a artéria coronária esquerda (LCA) e certifique-se que os pulmões não estão muito inflacionados. Otimizar a abertura do tórax para ter uma fixação segura do coração quando colocar a sutura. Se a pressão arterial está muito baixa a identificação pode ser complicada. Boli adicionais de solução salina pode melhorar a identificação do LCA. A LCA é um vaso vermelho brilhante cruzando o coração na horizontal (em contraste com as veias de retorno). Às vezes, o LCA é mais vistos sem um microscópio. Não use também muita luz. Isso pode levar a reflexões sever tornando impossível a visualização.
  7. Uma vez que o LCA é visualmente identificado, coloque um fio de náilon 8.0 (Prolene, Ethicon, Notiefies, EUA) em torno da LCA. Para efeitos de oclusão intermitente LCA, adotamos um modelo de cardiomiopatia crônica 42 usando um sistema de peso pendurado.
  8. Passe o fio através de um pequeno pedaço de tubo de plástico (PE-10 tubos) com bordas sem corte e anexar dois pequenos pesos (1g, por exemplo, utilização de tubos Eppendorf cheio de água) em cada extremidade. Com os pesos livremente pairando sobre uma haste, a LCA deve ser imediatamente ocluído. Além disso, quando o peso é aliviado, LCA oclusão é terminada de uma vez. Sucesso LCA oclusão deve ser confirmado por uma mudança de cor imediata do navio da luz vermelho ao violeta escuro, mudança de coloração do miocárdio fornecido pelo navio (de vermelho para branco) ea presença de ST-elevações da ECG. Durante a reperfusão, as mudanças de cor desaparecer instantaneamente. Manter o coração molhado com a 37 ° C, salina peça, embebido de algodão absorvente todo (ver também Figura 1).
  9. Escolheu o seu tempo de isquemia de acordo com seu interesse primário. Na verdade, para estudos dos efeitos cardioprotetores da IP, o ideal seria usar um tempo de isquemia associada a um infarto em tamanhos de aproximadamente 30 a 40% da AAR. Assim, seria possível demonstrar alterações em ambas as direções, tamanhos menores, com infarto, por exemplo IP cardíaca ou infarto tamanhos maiores com uma terapêutica experimental ou uma deleção do gene específico. Além disso, camundongos com um tamanho do infarto de menos de 50% normalmente sobreviver à experiência, ao passo que infarto tamanhos de 60 a 80% não são muitas vezes sobreviveram e os animais morrem antes do tempo de reperfusão é completa. Usando o nosso modelo de 10 minutos de isquemia do miocárdio seguido de 2 horas de reperfusão resulta em um tamanho do infarto de 3,5 ± 1,3% da AAR. Em contraste, um tempo de isquemia de 60 minutos resulta em um tamanho do infarto média de 42 ± 5,2% da AAR (p <0,01) 39. Assim, consideramos a 60 minutos de isquemia como ideal para estudar mudanças em ambas as direções. No entanto, você pode ter que ajustar o tempo de isquemia em ratos gene-alvo com um fenótipo sever.
  10. Escolheu o momento certo de reperfusão. O tempo de reperfusão é extremamente importante para a coloração TTC. O corante incolor é reduzida a um precipitado vermelho-tijolo-colorido por desidrogenases na presença do NADH co-enzima. Células que morrem perdem a capacidade de reter NADH e, portanto, são delineadas como áreas pálidas no miocárdio viável manchada de vermelho. Infarto delineamento tamanho por TTC exige que NADH foi lavada completamente da área de necrose. No entanto, se reperfusão não é suficientemente longo, delimitação do tamanho do infarto pela coloração TTC pode resultar em uma subestimação do tamanho do infarto real 43. Em nossas mãos, depois de um tempo de isquemia de 60 min, a medição do tamanho do infarto aumentou de 11,5 ± 4,5% depois de 30 minutos para 42,2 ± 5,1%após 120 minutos. Nenhum aumento no tamanho do infarto pode ser detectada com maior tempo de reperfusão (240 minutos) 39. Assim, recomendamos um período de duas horas de reperfusão que parece também razoável no contexto de determination.If enzimas cardíacas você considera isquemia pré-condicionamento, recomendamos 4 ciclos de IP (5 min de isquemia, reperfusão 5 min), seguido de um tempo de isquemia de 60 min e um tempo de 2 horas de reperfusão. Sob essas condições, IP foi associado com uma redução de 3,2 vezes do tamanho do infarto de 42,2 ± 5,1% para 13,3 ± 3,3% da AAR 39. No entanto, devido ao sistema de peso enforcamento, diferentes regimentos de pré-condicionamento poderia ser facilmente aplicada.

3. Determinação da Área At Risk (AAR) e tamanho do infarto

Após a indução de um infarto do miocárdio (com ou sem IP), a área é perfundido pela LCA (área de risco, AAR) e do tamanho do infarto em si será determinada utilizando uma técnica de coloração. Posteriormente, infarto será então calculada como porcentagem de infarto do miocárdio em comparação com o AAR. Para fazer isso, uma técnica de coloração descrito anteriormente dupla com cloreto de azul e trifeniltetrazólio Evan (TTC) é usada 44.

  1. Determinar a AAR pela injeção retrógrada de 1% de corante azul de Evan para a aorta, enquanto o LCA é ocluído. Alternativamente, se um cateter carotis está no lugar, use esta rota para Evans injeção de azul. Azul de Evans vai manchar todo azul do tecido do miocárdio, exceto a AAR. É fundamental para esta etapa para evitar bolhas de ar dentro do cateter, como seriam injetados na circulação coronariana e evitar manchas azul de Evan. Antes da coloração azul Evans você pode querer coletar sangue para dosagem de enzimas cardíacas. Além disso, a remoção de sangue através da injeção de 5 ml de soro fisiológico através de um cateter aórtica ou carotis é recomendado.
  2. O coração do consumo e lave em soro fisiológico gelado a 0,9%
  3. Incorporar em agarose 2%. Não use agarose quente desde que isso vai impedir a coloração bem sucedida.
  4. Após 30 minutos a 4 ° C (ou 15 minutos -20 ° C), corte o coração em fatias de 1 mm usando uma matriz de coração ou micrótomo. Se você colocar o coração no freezer evitar o congelamento seco, que vai levar à não corações manchados.
  5. Incubar as fatias com TTC 1% a 37 ° C por 10 min usando a 15 ml tampa azul em banho-maria. Isso permitirá que a área infartada a ser demarcada como área branca, enquanto que as manchas vermelhas tecido viável.
  6. Fixar as fatias corados com fomaldehyde 10% durante a noite. Ao fazer isso, a área infartada é melhor contraste melhoria da qualidade de imagens.
  7. Determinar a área de risco (AAR) e do tamanho do infarto por meio de planimetria usando o software NIH Imagem 1,0 45.
  8. Calcular o percentual de infarto do miocárdio a partir da área em risco.

4. Medição de enzimas cardíacas

Devido a limitações associadas a coloração TTC recomendamos leitura como adicional para a gravidade do infarto do miocárdio a determinação de troponina cardíaca I (cTnI) níveis no soro de camundongos. O sangue será obtido a partir da veia portal e os níveis séricos cTnI são, então, determinada com um ensaio de cTnI quantitativa rápida (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, EUA).

5. Resultados representativos:

Figura 1
Figura 1. (A) Modelo de IP cardíaca utilizando um sistema de suspensão de peso de oclusão coronária. Esta técnica não exige um nó para a oclusão coronária. (B, C) de instalação cirúrgica. (D) Imagem de um coração de camundongos com a artéria coronária esquerda (LCA, setas) após a oclusão. Identificação visual do LCA é necessário para ligadura e pré-condicionamento isquêmico em ratos. Uma sutura de nylon 8.0 é colocado ao redor do 1-2 mm LCA debaixo da orelha esquerda. A sutura é enfiada através de um pequeno tubo de plástico (*). O final de cada sutura é anexado a um pequeno peso (1g) ea sutura é colocada sobre as hastes dos dois lados. (E) Determinação da AAR LCA após oclusão e injeção retrógrada de corante azul de Evan para a aorta. A AAR permanece imaculada, enquanto o resto do miocárdio é azul. Após a incubação da AAR tecido com TTC, a área de infarto branco manchado, enquanto o vermelho manchado viável tecido.

Discussion

O presente estudo descreve uma nova técnica de realizar IP em um modelo murino intacta usando um sistema de suspensão de peso e evitando assim a oclusão da artéria coronária por um nó. De fato, este estudo demonstra tamanhos infarto altamente reprodutível e proteção cardíaca por IP, minimizando assim a variabilidade associada com nó modelos baseados em oclusão coronária. Investigadores que consideram estudar cardioproteção por IP em camundongos podem beneficiar deste modelo.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Os estudos atuais são suportados pelo National Heart, Lung, and Blood Institute Grant R01-HL0921, R01-R01-DK083385 e HL098294 para HK Eltzschig, o 1K08HL102267-01 a T. Eckle e Fundação para a Educação Anestesia e Bolsas de Investigação para T. Eckle e HK Eltzschig, e da American Heart Association para Grant T. Eckle e Eltzschig HK e uma bolsa de pesquisa Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) para M. Koeppen. Agradecemos a Shelley Eltzschig para a obra de arte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd V.P.L. 9372 4mg/mL in saline
TTC Sigma-Aldrich 17779 Fluka 1.5 % in PBS
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129 10g in 1 L PBS
Insyte 22 G BD Biosciences n/a
Suture, silk 4.0 Harvard Apparatus 517698
Suture, Prolene 8.0 Ethicon Inc. M8739 reusable
Heart Matrix Zivic Instruments # HSMS001
Siemens 900 C DRE Veterinary # 336 refurbished
dissecting microscope (SZX10 ) Olympus Corporation n/a consider generous working distance
Heating Table Rt, Effenberger, Germany n/a only and single provider
Blood pressure device Cyber Sense, Inc BPM02
I STAT Abbott Laboratories n/a

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Eckle, T., Koeppen, M., Eltzschig, H. Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (50), e2526, doi:10.3791/2526 (2011).

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