Summary
ويتكون الدماغ السمعية الدجاج من النوى المسؤولة عن معالجة الصوت الأذنين. A إعداد شريحة واحدة الاكليلية يحافظ على الدوائر كلها في حين أن النهج مثقف يوفر إعداد دراسة فريدة من نوعها لتطوير البنية العصبية وظيفة السمع على الصعيدين الجزيئية والخلوية وشبكة الاتصال.
Abstract
جذع الدماغ السمعية الدجاج هو النظام النموذجي الراسخة التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء من تجهيز السمعية في فترات رصينة للتنمية 1-4 فضلا عن آليات لترميز الزمنية في النظام العصبي المركزي 5-7.
هنا نقدم طريقة لتحضير شرائح الدجاج الدماغ السمعية التي يمكن استخدامها لإجراءات تجريبية حادة أو لشرائح ثقافة عضوي النمط على المدى الطويل التلاعب التجريبية.
يتكون الدماغ السمعية الدجاج من الزاوي النواة ، magnocellularis والزيتون laminaris ومتفوقة. هذه النواة هي المسؤولة عن معالجة الصوت والأذنين واحد الاستعدادات شريحة الاكليلية الحفاظ على الدوائر كلها. وفي نهاية المطاف ، يمكن للثقافات شريحة عضوي النمط يتيح الفرصة للتلاعب المعلمات تنموية عدة مثل النشاط متشابك ، والتعبير من قبل عناصر وبعد المشبكي ، والتعبير عن جوانب السيطرة على استثارة والتفاضلية التعبير الجيني
ويمكن استخدام هذا النهج لتوسيع المعرفة العامة حول تطوير الدوائر العصبية ، والصقل والنضج.
Protocol
1. إعداد تشريح المنطقة
- فقاعة مصطنعة باستمرار السائل الشوكي الدماغي (ACSF) مع خليط من 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2 (درجة الحموضة بين 7،2-7،4 ، الأسمولية 295-310 mOsm / لتر).
- بينما هو ACSF محتدما ونظيفة ومنطقة عمل مع EtOH 70 ٪. أيضا تنظيف vibratome ونصل التقطيع. شفرة شطف مع الماء المقطر (DH 2 O).
- مكان نظيف لوحة امتصاص السوائل على تشريح المنطقة مع الأدوات المناسبة لتشريح.
- الغراء كتلة آغار (40 ملغ agarose / مل ، أي 4 ٪ ، في DH 2 O) إلى مرحلة غرفة vibratome - تشريح *.
* نصيحة : إعداد آغار قبل تشريح. مخزن مسبقة الصنع أجار داخل صحن بتري مغطاة في الثلاجة. اشترى Agarose من المواد الكيميائية أو Invitrogen EMD.
2. 6 إعداد جيد لوحات متوسطة مع الثقافة
- تحت غطاء العقيمة ، وملء 1 جيد للحيوان الواحد من لوحة 6 - جيدا مع 1 مل من احتضان الثقافة والمتوسطة على 35 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
- إعداد وإدراج العديد من الغشاء الثقافة حسب الحاجة ووضعها في غطاء محرك السيارة لاستخدامها لاحقا.
3. عزل الدماغ السمعية الدجاج
- البيض في ظل مصدر الضوء الساطع لتحديد المجال الجوي ملأت الفراغ الجنين (عادة في الجانب كبيرة من البيض).
- كسر فتح الجانب الكبير من البيض تعريض الكيس الغشاء. جعل شريحة في غشاء كيس مع مشرط وإزالة بلطف رأس الجنين الدجاج.
- قطع رأس رئيس بسرعة مع المقص.
- تلميح بدلا من شفرة حلاقة والخلفي قليلا الى ما بين عينيه. جعل شق منقاري إلى الذيلية خط الوسط من خلال ممارسة الضغط في الجمجمة طفيفة *.
* نصيحة : الضغوط التي مورست يعتمد على عمر الجنين (أي الأصغر = أقل والمسنين = أكثر) - دفع جانبا برفق الجلد والريش لفضح الجمجمة والتحقق من قطع خط الوسط.
- كتلة جزء منقاري الجمجمة عن طريق تشريح بشفرة حلاقة. شفرة الموقف الخلفي للعيون وقطع بسرعة من خلال الجمجمة كلها وأنسجة المخ *.
مطلوب لضغوط قوية لإزالة القسم منقاري : * تلميح. - جعل خط الوسط الى الاطراف مع مقص شقوق صغيرة في المنطقة الذيلية من الجمجمة ، الأمامي قليلا لعضلات الرقبة واضحة على كلا الجانبين من الرأس. أبتعد الجمجمة والأنسجة لفضح المخيخ والدماغ.
- إزالة بلطف من قاعدة الجمجمة الدماغ عن طريق قطع الأنسجة مرفقة مع مقص صغير. بمجرد أن يتم قطع جميع الأنسجة ، ويجب أن الدماغ تتحرك بحرية بعيدا عن جمجمة *.
* نصيحة : قد تحتاج إلى الوجه الجمجمة (أسفل المخ) لقطع الأنسجة المرفقة.
4. إعداد لتشريح الدماغ
- إزالة مرة واحدة من الجمجمة والدماغ دبوس أسفل عبر السقفية البصري.
- تماما إزالة المخيخ عن طريق خفض بلطف السويقتين مع مقص صغير ، وفضح الكلمة من البطين الرابع.
- إزالة أي نوع من الأنسجة والأوعية الدموية غشائي من سطح الدماغ مع ملاقط وإجراء تخفيضات الوحشي من خلال السقفية البصري إلى عزل الدماغ.
- ضع كمية صغيرة من الغراء عظمى على المسرح vibratome أمام كتلة آغار (نحو النصل vibratome).
- باستخدام الملقط ، بلطف وبسرعة رفع جذع الدماغ في الحبل الشوكي والأنسجة مكان على الغراء عظمى مع الجانب منقاري أسفل وإلى الجانب الظهري نحو vibratome شفرة *.
* نصيحة : يجب أن يتم استيعاب فائض الغراء مع كيم يمسح أو تصفية الورق قبل الخطوة التالية. - تصب بلطف ACSF الاوكسيجين الى المرحلة vibratome *.
* ملاحظة : يمكن هذا ACSF فقاعات باستمرار مع O 2 / CO 2. ومع ذلك ، ظهرت على السطح من ACSF في حجم صغير مثل هذا الحل من النتائج غير المرغوب فيها في حركة (والضرر المحتمل) لشرائح الدماغ. إذا أجريت بسرعة ، الاوكسيجين بالفعل ACSF من تشريح كافية. - وينبغي أن يكون Vibratome شفرة بزاوية ° 20-22. بدء vibratome (يجب وضع التذبذب في السعة القصوى) ، والتحرك نحو مرحلة حتى نصل حتى الجزء العلوي من الأنسجة بالتوازي مع شفرة قبل التقطيع.
- التحرك بسرعة نحو الأنسجة شفرة الدماغ. يتباطأ بدرجة كبيرة قبيل شفرة الاتصال مع الأنسجة.
- يبدأ تشريح الأنسجة مع الحركة إلى الأمام أبطأ ممكن. مرة واحدة من خلال قسم كامل من نسيج الاكليلية ، حرك بلطف بعيدا عن شريحة شفرة بفرشاة أو الزجاج المكسور ، أطلقت ماصة مصقول ، وتناسب في نهاية واحدة مع لمبة المطاط.
- انخفاض في المرحلة 300-500 ميكرون وشريحة الخطوات مرة أخرى. كرر حتى التوقيعات التشريحية مرئية في أنسجة الدماغ. في هذا الوقت ، تحتوي على شريحة أنسجة الدماغ السمعية في هياكل 200-1000 ميكرون سمك ، اعتمادا على سن احتياجات الأنسجة والتجريبية.
- الحفاظ بعناية شرائح قابلة للاستخدام في ترتيب تشريح ، أي شريحة ش 1 يمثل المنطقة الأكثر الذيلية للدائرة (التردد المنخفض الصوت التجهيز) وشريحة الماضية تمثل القسم الأكثر منقاري (عالية التردد processiنغ) *.
* ملاحظة : بالنسبة للوضع شرائح للاستخدام والثقافة ، وانتقل إلى الباب 6. لتخزين الفيزيولوجيا في المختبر ، راجع المقطع التالي.
5. التخزين لشريحة في المختبر فسيولوجيا
- اعتمادا على عمر الجنين الدجاج وسمك شريحة ، وينبغي توفير كل حيوان 1-6 شرائح.
- المكان بلطف شرائح الفردية في الغرفة باستخدام ماصة الزجاج المصقول النار تركيبها في نهاية واحدة مع لمبة المطاط. يجب ترقيم الغرفة. المكان الوحيد في شريحة واحدة بشكل جيد ، من أجل الحفاظ على خصوصية بعض التوضع النغمي (مثلا ، شريحة الأكثر الذيلية في غرفة (1) وشريحة الأكثر منقاري في غرفة الماضي). ينبغي أن تملأ الغرفة مع ACSF وانفجر بشكل مستمر مع خليط من 95 ٪ O 2 / 5 ٪ CO 2 (7.4 درجة الحموضة ، الأسمولية 295-310 mOsm / لتر).
- شرائح تسمح للتوازن من خلال وضع في غرفة حمام دافئ (36 درجة مئوية) لحوالي 1 ساعة.
- إزالة غرفة من حمام دافئ ، والسماح للراحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ونصف تقريبا.
- بعد ساعة ونصف في درجة حرارة الغرفة ، يمكن نقل شرائح من الغرفة إلى عقد ~ 0.5 مل غرفة تسجيل محمولة على المجهر لتجارب الكهربية.
- ويمكن استخدام شرائح لمدة تصل الى 6 ساعات بعد إزالة ~ من حمام دافئ.
6. التحضير للثقافات شريحة عضوي النمط 8
- مباشرة بعد إجراء تشريح (انظر القسم 6) مع شرائح نقل ACSF 500 ~ ميكرولتر باستخدام ماصة الزجاج المصقول النار تركيبها في نهاية واحدة مع لمبة المطاطية ل48 لوحة جيدا على الجليد. شريحة واحدة لكل بئر *.
* تلميح : شرائح تحتاج إلى ما لا يقل عن 300 ميكرون وتصل إلى 1000 ميكرون سميكة. - بعد الانتهاء من جمع شرائح ، ونقل لوحة 48 - جيدا للغطاء محرك السيارة.
- إزالة 6 - جيدا لوحة تحتوي على مستنبت للخروج من الحاضنة وتحويلها إلى غطاء محرك السيارة.
- فقط قبل وضع شرائح من دماغ واحد على الأغشية ، ومكان واحد لإدراج غشاء المعدة (أنظر القسم 2.2) في بئر مع الثقافة المتوسطة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء تحت الغشاء.
- باستخدام ماصة الزجاج ، ونقل شريحة في قطرة من ACSF على الغشاء الثقافة وإزالة الزائدة ACSF مع micropipette. تكرار للشرائح المتبقية (حد أقصى 4 شرائح في الغشاء) *.
* تلميح : تأكد من شرائح لا تلمس بعضها البعض ، وشرائح مكان مركزيا على الغشاء بحيث لا تلمس حافة الغشاء. - تكرار للشرائح والعديد من الدماغ حسب الحاجة *.
* نصيحة : إذا تم التلاعب بها الثقافات في نقطة وقت لاحق ، قد يكون من المفيد للحد من كمية الأغشية إلى 3 في 6 - جيدا لوحة العمل على التقليل من الوقت الذي يتم إزالة الثقافات من الحاضنة. - تغيير مستنبت 3 مرات في الأسبوع تحت غطاء : إزالة المتوسطة القديمة مع أنبوب فراغ مع طرف العقيمة في حين يتم رفع إدراج غشاء من البئر مع زوج من الملقط. إضافة 1 مل من مستنبت الطازجة بشكل جيد في حين يتم رفع إدراج غشاء من البئر. عندما يتم تغيير كافة المتوسطة ، ووضع لوحة العودة إلى الحاضنة.
7. ممثل النتائج :
الشكل 1. الأذنين الدوائر من الدجاج الدماغ السمعية (A) تخطيطي لمقطع الاكليلية و (BF) صور شريحة في المختبر من الدجاج الدماغ السمعية. في الدائرة (أ) تبين المدخلات مثير وارد من العصب السمعي (AN) لmagnocellularis النواة (نيو مكسيكو) ونواة الزاوي (NA). NM مشاريع المدخلات مثير للlaminaris الثنائية النواة (NL) على كلا الجانبين من الدماغ. مدخلا المثبطة من المشاريع متفوقة الزيتوني (SON) نواة لNA ، NM وNL. شرائح في المختبر في (BF) عبارة عن صور متسلسلة (200 ميكرومتر لكل منهما) الانتقال من الذيلية (B) لمنقاري (F) من الدجاج الدماغ السمعية ، ويمثل لالمنخفضة عالية التردد المناطق ، على التوالي. الدوائر هي المسؤولة عن الخصائص الزمانية ترميز الصوت المستخدمة في المقام الأول لتوطين الصوت. النطاق في شريط (B) = 500 ميكرون وينطبق على الصور في (CF). الأسهم في (D) نقطة إلى طبقة واحدة من خلايا الجسم NL.
الشكل 2. تطوير الخلايا العصبية مثقف العادي خصائص الاستجابة الفسيولوجية. التغييرات الجهد لتركيب غشاء ردا على hyperpolarizing depolarizing والخطوات الحالية الحادة من (A & C) والأنسجة مثقف في 4 (ب) و 7 (D) في أيام الثقافة (DIC). تغييرات في مذكرة hyperpolarizing الجهد "الترهل" ، والحد الحالية قوية في الخارج ، واطلاق واحدة AP التي تتطور على نحو مماثل في شريحة نهج ثقافة مقارنة الأنسجة سن حادة مماثلة. وكانت الحقن الحالية 200 مللي ، خطوات 5-10 السلطة الفلسطينية. وكانت خطط إدارة غازات التبريد بالسيارات بين -55 و -60.
الشكل 3. التشريحية في بنية الثقافة SLIالمجال الاقتصادي الموحد. النصف الأيسر من الدماغ السمعية من الدجاج E11 بعد 7 أيام في الثقافة (DIC). هو المسمى جسم ضد البروتينات المرتبطة أنيبيب 2 (MAP2) ، والذي يحدث في سوما والتشعبات ، والأخضر. وصفت كتلة نواة الخلايا العصبية (NM) magnocellularis والمحاوير في الحمراء عبر electroporation لصبغ ديكستران اليكسا. وكلا NM خط خلية NL مرئية. ويمكن رؤية المماثل محطات محوار NM إسقاط إلى التشعبات NL الظهرية (السهام البيضاء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لعدة عقود ، وقد استخدمت في إعداد شريحة حاد في الدماغ السمعية الدجاج لدراسة تجهيز 9 و 10. وقد قدم هذا النهج على كمية هائلة من البيانات في المختبر الفيزيولوجي على معالجة الأذنين من كل من الولايات التنموية وناضجة 4 ، 11 ، 12. ويعرف الكثير عن هذه الدائرة درجة عالية من التخصص ودور كل نواة يلعب في تجهيز الزمني للصوت 13 و 14. في الواقع ، لقد ثبت على المدى القصير التلاعب التجريبية وآثارها على بنية ووظيفة هذه الدائرة جيدا اتسم 15 المفيد. من منظور طويل الأجل التنموية ومع ذلك ، مثل هذه المعالجات ليست ممكنة ، ويبرر التقنيات لمعالجة هذه المسألة. هنا نقترح أسلوب الرواية الذي يوفر فرصة للتحقيق في مثل هذه المسائل. في نهاية المطاف ، والثقافات شريحة عضوي النمط توفير امكانية للتلاعب نشاط متشابك واللوائح قناة الجوهرية ، والاستجابات مستقبلات بعد المشبكي ، والفرق التعبير الجيني في فترات محددة والتنموية على مدى طويل. وهذا النهج مواصلة بناء على معرفة واسعة من الدجاج الدائرة السمعية ومساعدة العلماء في فهم أفضل الأسئلة الأساسية حول التنمية العصبية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
أعضاء حاليين وسابقين مختبر روبل.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken ACSF | ||||
| NaCl | Fisher Scientific | M-11624 | 130 mM | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | M-10576 | 26 mM | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P-9333 | 3 mM | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S-8282 | 1.25 mM | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | 10 mM | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | 1 mM | |
| CaCl2 | Acros Organics | 423525000 | 2 mM | |
| Chicken culture medium (store at 4°C) | ||||
| advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate) | GIBCO, by Life Technologies | 12492-013 | 48.00% | |
| Earl’s balanced salt solution | Sigma-Aldrich | E-2888 | 24.00% | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma-Aldrich | G-7513 | 1.00% | |
| Glucose solution (200 g/l, sterile filtered) | Sigma-Aldrich | G-7528 | 2.75% | |
| horse serum (heat inactivated, sterile filtered) | Sigma-Aldrich | H-1138 | 24.00% | |
| Penicillin-streptomycin* | Sigma-Aldrich | P-0781 | 1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination |
|
| Specific equipment | ||||
| Millicell-CM cell culture inserts | PICMORG50 | EMD Millipore | ||
| 6-well plate | 6 Well Cell Culture Cluster | Corning | ||
| Incubator | Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific |
References
- Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents. J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).
- Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken. J Physiol. 540, 529-542 (2002).
- Gao, H., Lu, Y. Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons. Neuroscience. 153, 131-143 (2008).
- Sanchez, J. T., Wang, Y., Rubel, E. W., Barria, A. Development of glutamatergic synaptic transmission in binaural auditory neurons. J Neurophysiol. 104, 1774-1789 (2010).
- Jackson, H., Hackett, J. T., Rubel, E. W. Organization and development of brain stem auditory nuclei in the chick: ontogeny of postsynaptic responses. J Comp Neurol. 210, 80-86 (1982).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164, 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166, 469-489 (1976).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Reyes, A. D., Rubel, E. W., Spain, W. J. Membrane properties underlying the firing of neurons in the avian cochlear nucleus. J Neurosci. 14, 5352-5364 (1994).
- Monsivais, P., Rubel, E. W. Accommodation enhances depolarizing inhibition in central neurons. J Neurosci. 21, 7823-7830 (2001).
- Lu, T., Trussell, L. O. Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus. J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).
- Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).
- Trussell, L. O. Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways. Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).
- Trussell, L. O. Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons. Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).
- Sorensen, S. A., Rubel, E. W. The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure. J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).
