Summary
De kip auditieve hersenstam bestaat uit de kernen die verantwoordelijk is voor de binaurale geluidsbewerking. Een enkele coronale slice voorbereiding onderhoudt het hele circuit, terwijl de gekweekte aanpak biedt een unieke voorbereiding op de ontwikkeling van neuronale structuur en auditieve functie bestuderen op moleculair, cellulair en netwerk niveau.
Abstract
De kip auditieve hersenstam is een goed uitgewerkt model systeem dat op grote schaal is gebruikt om de anatomie en fysiologie van de auditieve verwerking studie op discrete periodes van ontwikkeling 1-4 evenals mechanismen voor de tijdelijke codering in het centrale zenuwstelsel 5-7.
Hier presenteren wij een methode om kip auditieve hersenstam plakjes die kunnen worden gebruikt voor acute experimentele procedures of de cultuur organotypische plakken voor de lange termijn experimentele manipulaties te bereiden.
De kip auditieve hersenstam bestaat uit kern angularis, magnocellularis, laminaris en superieure olijfolie. Deze kernen zijn verantwoordelijk voor de binaurale geluidsverwerking en een coronale slice voorbereidingen behoud van de gehele circuit. Uiteindelijk kan organotypische slice culturen bieden de mogelijkheid om een aantal ontwikkelings-parameters zoals synaptische activiteit, expressie van pre-en postsynaptische componenten, uitdrukking van de aspecten beheersen prikkelbaarheid en differentiële genexpressie te manipuleren
Deze benadering kan worden gebruikt om de algemene kennis over het neurale circuit ontwikkeling, verfijning en rijping te verbreden.
Protocol
1. De voorbereiding van ontleden omgeving
- Continu bubble kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met een mengsel van 95% O 2 / 5% CO 2 (pH tussen 7.2-7.4, osmolariteit 295-310 mOsm / l).
- Terwijl ACSF bruist, schone werkruimte met 70% EtOH. Reinig ook de vibratome en snijmes. Spoel blad met gedestilleerd water (dH 2 O).
- Plaats schoon vochtopname pad op ontleden gebied met de juiste tools te ontleden.
- Lijm agar blok (40 mg agarose / ml, dat wil zeggen 4%, in dH 2 O) tot het stadium van een vibratome-slicing kamer *.
* Tip: voor te bereiden agar aan dissectie. Store pre-made agar in een overdekte petrischaal in de koelkast. Agarose gekocht bij Merck Chemicals of Invitrogen.
2. Voorbereiding van de 6-well platen met kweekmedium
- Onder een steriele motorkap, goed te vullen 1 per dier van een 6-wells plaat met 1 ml kweekmedium en incubeer bij 35 ° C en 5% CO 2.
- Bereid zo veel cultuur membraan inserts als nodig en plaats ze in kap voor later gebruik.
3. Isolatie van Chicken Auditieve Brainstem
- Plaats ei onder een felle lichtbron aan de lucht gevulde ruimte leegte van het embryo (meestal de grote kant van het ei) te bepalen.
- Open te breken grote kant van het ei bloot membraan weg. Maak slice in membraan zak met scalpel en verwijder voorzichtig de kop van de kip embryo.
- Snel onthoofden kop met een schaar.
- Plaats tip van scheermesje iets posterior naar en tussen de ogen. Maak een rostrale-to-caudale middellijn incisie door de schedel die alleen lichte druk *.
* Tip: druk uitgeoefend is afhankelijk van de leeftijd van de embryo (dat wil zeggen, de jongere = minder, ouder = meer) - Duw opzij huid en veren op de schedel bloot te leggen en te controleren middellijn te snijden.
- Blok rostrale deel van de schedel door het snijden met een scheermesje. Positie mes posterior voor de ogen en snel te snijden door hele schedel-en hersenweefsel *.
* Tip: sterke druk is nodig om volledig te verwijderen rostrale gedeelte. - Maak middellijn-to-laterale insnijdingen met een klein schaartje in de caudale regio van de schedel, licht anterior zichtbaar nekspieren aan beide zijden van het hoofd. Weg te trekken schedel en weefsel te kleine hersenen en de hersenen bloot te leggen.
- Verwijder voorzichtig hersenstam van de schedelbasis door te snijden bevestigd weefsel met een klein schaartje. Zodra alle weefsel is gesneden, moeten hersenstam weg vrij bewegen van de schedel *.
* Tip: u kan nodig zijn om de schedel (hersenen naar beneden) flip bijgevoegde weefsel te snijden.
4. Voorbereiding van de hersenstam voor het snijden van
- Eenmaal buiten de schedel, pin hersenstam naar beneden door de optische tecta.
- Volledig verwijderen van de kleine hersenen door voorzichtig het snijden van de steeltjes met een klein schaartje, waardoor de vloer van de vierde ventrikel.
- Verwijder eventuele membraneuze weefsel en bloedvaten van het oppervlak van de hersenstam met een pincet en maak laterale snijdt door de optische tecta om de hersenstam te isoleren.
- Plaats een kleine hoeveelheid van de super lijm op de vibratome podium voor de agar blok (de richting van de vibratome mes).
- Met een pincet voorzichtig en snel til de hersenstam aan het ruggenmerg en plaats weefsel op de super lijm met de rostrale naar beneden en dorsale kant naar te vibratome blad *.
* Tip: overtollige lijm moet worden opgenomen met een kim-wipe of papier voor de volgende stap filter. - Giet zuurstof ACSF in de vibratome podium *.
* Let op: dit ACSF kan continu worden borrelen met O 2 / CO 2. Echter, borrelende van ACSF in zo'n klein volume van de oplossing resulteert in een ongewenste beweging (en mogelijke schade) naar hersenstam plakken. Als snel uitgevoerd, al zuurstof ACSF van de dissectie voldoende is. - Vibratome mes moet worden bij een 20-22 ° hoek. Start vibratome (oscillatie moet worden vastgesteld op een maximale amplitude) en ga het podium op naar het mes, zodat de bovenkant van het weefsel parallel is met het blad alvorens te snijden.
- Snel mes naar hersenstam weefsel. Vertragen aanzienlijk vlak voor het blad contact met weefsel.
- Begin het snijden van weefsel met laagst mogelijke voorwaartse beweging. Eenmaal door de hele coronale gedeelte van het weefsel, beweeg slice uit de buurt van het mes met een borstel of een gebroken glas, vuurde gepolijst pipet, fit aan de ene kant met een rubberen bol.
- Lager niveau in 300 tot 500 micrometer stappen en slice opnieuw. Herhaal dit tot anatomische handtekeningen zijn zichtbaar in hersenstam weefsel. Op dit moment, slice hersenstam weefsel met auditieve structuren op 200-1000 micrometer dikte, afhankelijk van de leeftijd van het weefsel en experimentele behoeften.
- Zorgvuldig onderhouden bruikbaar plakken in de volgorde van in plakken snijden, dat wil zeggen, de 1 ste plak vertegenwoordigt de meest caudale regio van het circuit (laagfrequent geluid verwerking) en de laatste slice is de meest rostrale gedeelte (hoge frequentie processing) *.
* Opmerking: voor de plaatsing van schijfjes voor cultuur te gebruiken, gaat u naar hoofdstuk 6. Voor in-vitro fysiologie opslag, zie het volgende hoofdstuk.
5. Snijd opslag voor in-vitro Fysiologie
- Afhankelijk van de leeftijd van de kip embryo en de dikte van het schijfje, moet elk dier te bieden 1-6 plakjes.
- Plaats voorzichtig afzonderlijke segmenten in de kamer met behulp van vuur geslepen glazen pipet gemonteerd aan een uiteinde met een rubberen bol. Kamer moet worden genummerd. Plaats slechts een plakje per goed, om een aantal tonotopische specificiteit (bv. meest caudale schijfje in de kamer 1 en de meest rostrale slice in de laatste kamer) te handhaven. Kamer moet worden gevuld met ACSF en continu borrelen met een mengsel van 95% O 2 / 5% CO 2 (pH 7,4, osmolariteit 295-310 mOsm / l).
- Laat plakken in evenwicht door het plaatsen van de kamer in een warm bad (36 ° C) gedurende ongeveer een uur.
- Verwijder de kamer van warm bad en laat ze op kamertemperatuur rusten voor ongeveer ½ uur.
- Na een ½ uur bij kamertemperatuur, kunnen plakjes worden overgedragen van het bedrijf kamer naar een ~ 0,5 ml opname kamer gemonteerd op een microscoop voor elektrofysiologische experimenten.
- Slices kunnen worden gebruikt voor tot ~ 6 uur na verwijdering uit het warme bad.
6. De voorbereiding van organotypische Slice Culturen 8
- Onmiddellijk na het snijden procedure (zie hoofdstuk 6) overdracht plakjes met ~ 500 pL ACSF met behulp van een brand geslepen glazen pipet gemonteerd aan een uiteinde met een rubberen bol om een 48 wells plaat op ijs. Een schijfje per goed *.
* Tip: Slices moet minstens 300 um en tot 1000 micrometer dik. - Na het plakken zijn verzameld, de overdracht van de 48-wells plaat aan de kap.
- Verwijderen van een 6-well plaat met kweekmedium uit de incubator en over te dragen aan de kap.
- Net voor het plaatsen van segmenten van een enkel brein op membranen, een van de bereide membraan inserts plaats (zie paragraaf 2.2) in een goed met kweekmedium. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn onder membraan.
- Met behulp van een glazen pipet een slice in een daling van ACSF op de cultuur membraan en verwijder overtollig ACSF met een micropipet. Herhaal dit voor de resterende plakjes (max 4 sneden per membraan) *.
* Tip: Zorg ervoor dat plakken niet elkaar raken en centraal plaats plakjes op het membraan, zodat ze niet aanraken het membraan velg. - Herhaal dit voor zoveel als nodig de hersenen plakjes *.
* Tip: Als culturen worden gemanipuleerd op een later tijdstip, is het misschien voordelig zijn om de hoeveelheid van de membranen te beperken tot 3 per 6-well plaat als op het moment dat de culturen worden verwijderd uit de couveuse te verminderen. - Verandering kweekmedium 3 keer per week onder een kap: Verwijder oude medium met een vacuüm buis met een steriele tip terwijl membraan insert wordt opgetild uit de put met een pincet. Voeg 1 ml vers kweekmedium in een goed, terwijl membraan insert wordt opgetild uit de put. Als alle medium is veranderd, weer plaat in de couveuse.
7. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Binaurale circuit van de kip auditieve hersenstam. (A) Schematische voorstelling van een coronale sectie en (BF) in-vitro slice beelden van de kip auditieve hersenstam. Het circuit in (A) toont afferente prikkelende input van de gehoorzenuw (AN) naar nucleus magnocellularis (NM) en de nucleus angularis (NA). NM projecten bilaterale excitatoire inputs naar kern laminaris (NL) aan beide zijden van de hersenstam. Een remmende input van de superieure olivary kern (SON) projecten aan NA, NM en NL. De in-vitro plakken in (BF) zijn opeenvolgende beelden (200 micrometer per stuk) gaat van caudaal (B) rostraal (F) van de kip auditieve hersenstam, die de lage tot hoge frequentie regio's, respectievelijk. Circuitry is verantwoordelijk voor het coderen van temporele eigenschappen van het geluid voornamelijk gebruikt voor geluidslokalisatie. Schaalbalk in (B) = 500 micrometer en geldt voor beelden in (CF). Pijlen in (D) wijzen op de enkele cel lichaam laag van NL.
Figuur 2. Gekweekte neuronen ontwikkelen van een normale fysiologische respons-eigenschappen. Gesuperponeerd membraan spanning verandert in reactie op hyperpolarizing en depolariserende huidige stappen van acute (A & C) en gekweekt weefsel bij 4 (B) en 7 (D) dag in de cultuur (DIC). Let op veranderingen in de hyperpolarizing spanning "sag", een sterke vermindering van de naar buiten stroom, en single AP vuren die op vergelijkbare wijze te ontwikkelen in de slice cultuur benadering ten opzichte van vergelijkbare leeftijd acute weefsel. Huidige injecties werden 200 ms, stappen van 50-100 pA. RMPS waren tussen -55 en -60 mV.
Figuur 3. Anatomische structuur in cultuur slices. linker helft van het auditieve hersenstam van een E11 kip na 7 dagen in de cultuur (DIC). Een antilichaam tegen de microtubuli-geassocieerde eiwit 2 (MAP2), die optreedt in de soma en de dendrieten, het label in het groen. Een cluster van de kern van magnocellularis (NM) neuronen en de axonen worden gelabeld in het rood door elektroporatie van een Alexa dextran kleurstof. Zowel NM en de NL cellijn zichtbaar zijn. Ipsilaterale NM axon terminals kan worden gezien projecteren naar de dorsale NL dendrieten (witte pijlpunten).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tientallen jaren, is de acute slice voorbereiding van de kip hersenstam is gebruikt om te studeren auditieve verwerking van 9, 10. Deze aanpak heeft een enorme hoeveelheid in-vitro-fysiologische gegevens over binaurale verwerking van zowel de ontwikkelings-en volwassen staten 4, 11, 12. Veel is bekend over deze zeer specialistische circuit en de rol die elke kern speelt in de temporele verwerking van geluid 13, 14. In feite hebben op korte termijn experimentele manipulaties en hun effecten op de structuur en functie van deze goed gekarakteriseerde circuit bewezen voordelig 15. Vanuit een lange termijn ontwikkelingsperspectief echter dergelijke manipulaties zijn niet mogelijk en technieken om dit probleem aan te pakken zijn gerechtvaardigd. Hier stellen we een nieuwe techniek die de mogelijkheid om dergelijke vragen te onderzoeken biedt. Uiteindelijk organotypische slice culturen bieden het vooruitzicht om synaptische activiteit, intrinsieke kanaal regelgeving, postsynaptische receptor responsen, en differentiële genexpressie op specifieke en over lange periodes ontwikkeling te manipuleren. Deze aanpak zal verder bouwen op de uitgebreide kennis van de kip auditieve circuit en een betere wetenschappers te helpen bij het begrijpen van fundamentele vragen over de neurobiologische ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Huidige en voormalige Roebel lab leden.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken ACSF | ||||
| NaCl | Fisher Scientific | M-11624 | 130 mM | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | M-10576 | 26 mM | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P-9333 | 3 mM | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S-8282 | 1.25 mM | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | 10 mM | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | 1 mM | |
| CaCl2 | Acros Organics | 423525000 | 2 mM | |
| Chicken culture medium (store at 4°C) | ||||
| advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate) | GIBCO, by Life Technologies | 12492-013 | 48.00% | |
| Earl’s balanced salt solution | Sigma-Aldrich | E-2888 | 24.00% | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma-Aldrich | G-7513 | 1.00% | |
| Glucose solution (200 g/l, sterile filtered) | Sigma-Aldrich | G-7528 | 2.75% | |
| horse serum (heat inactivated, sterile filtered) | Sigma-Aldrich | H-1138 | 24.00% | |
| Penicillin-streptomycin* | Sigma-Aldrich | P-0781 | 1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination |
|
| Specific equipment | ||||
| Millicell-CM cell culture inserts | PICMORG50 | EMD Millipore | ||
| 6-well plate | 6 Well Cell Culture Cluster | Corning | ||
| Incubator | Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific |
References
- Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents. J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).
- Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken. J Physiol. 540, 529-542 (2002).
- Gao, H., Lu, Y. Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons. Neuroscience. 153, 131-143 (2008).
- Sanchez, J. T., Wang, Y., Rubel, E. W., Barria, A. Development of glutamatergic synaptic transmission in binaural auditory neurons. J Neurophysiol. 104, 1774-1789 (2010).
- Jackson, H., Hackett, J. T., Rubel, E. W. Organization and development of brain stem auditory nuclei in the chick: ontogeny of postsynaptic responses. J Comp Neurol. 210, 80-86 (1982).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164, 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166, 469-489 (1976).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Reyes, A. D., Rubel, E. W., Spain, W. J. Membrane properties underlying the firing of neurons in the avian cochlear nucleus. J Neurosci. 14, 5352-5364 (1994).
- Monsivais, P., Rubel, E. W. Accommodation enhances depolarizing inhibition in central neurons. J Neurosci. 21, 7823-7830 (2001).
- Lu, T., Trussell, L. O. Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus. J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).
- Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).
- Trussell, L. O. Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways. Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).
- Trussell, L. O. Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons. Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).
- Sorensen, S. A., Rubel, E. W. The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure. J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).
