Summary
Kycklingen auditiva hjärnstammen består av atomkärnor ansvarig för binaural ljudbehandling. En enda koronalt skiva förberedelse upprätthåller hela kretsar medan de odlade metod ger en unik förberedelse för att studera utvecklingen av neuronala struktur och auditiv funktion på molekylär, cellulär och nätverk nivåer.
Abstract
Kycklingen hörsel hjärnstammen är en väl etablerad modell system som har använts i stor utsträckning för att studera anatomi och fysiologi ljudbearbetning i diskreta perioder av utveckling 1-4 samt mekanismer för temporal kodning i det centrala nervsystemet 5-7.
Här presenterar vi en metod för att förbereda kyckling skivor auditiva hjärnstammen som kan användas för akut experimentella metoder eller att kultur organotypic skivor för långsiktiga experimentella manipulationer.
Kycklingen auditiva hjärnstammen består av kärnan angularis, magnocellularis, laminaris och överlägsen oliv. Dessa kärnor är ansvariga för binaural ljudbearbetning och ensamstående koronala förberedelser skiva bevara hela kretsen. I slutändan kan organotypic slice kulturer ger möjlighet att manipulera flera utvecklingsmässiga parametrar som synaptisk aktivitet, uttryck av pre-och postsynaptiska komponenter, uttryck för aspekter kontrollera retbarhet och differentierad genuttryck
Denna metod kan användas för att bredda den allmänna kunskapen om neural krets utveckling, förädling och mognad.
Protocol
1. Beredning av Analysera område
- Kontinuerligt bubbla konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) med en blandning av 95% O 2 / 5% CO 2 (pH mellan 7,2-7,4, osmolaritet 295-310 mOsm / l).
- Medan ACSF bubblar, rengör arbetsområdet med 70% EtOH. Rengör även vibratome och skärbladet. Skölj blad med destillerat vatten (dH 2 O).
- Placera ren pad vätskeabsorption på dissekera område med lämpliga dissekera verktyg.
- Limma agar blocket (40 mg agaros / ml, dvs 4%, i dH 2 O) till stadiet av en vibratome-skivas kammare *.
* Tips: Förbered agar före dissekering. Förvara färdiga agar i en övertäckt petriskål i kylskåpet. Agarosen köpts från EMD kemikalier eller Invitrogen.
2. Preparat av 6-brunnars plattor med odlingsmedium
- Enligt en steril huva, fylla en väl per djur av en 6-brunnar med 1 ml odlingsmedium och inkubera vid 35 ° C och 5% CO 2.
- Förbered så många kultur membran insatser som behövs och placera dem i huva för senare användning.
3. Isolering av Kyckling Auditiv hjärnstammen
- Placera ägget i en stark ljuskälla för att bestämma luftfyllda utrymmet ogiltig av embryot (vanligtvis den stora delen av ägget).
- Break öppna stora sidan av ägg utsätta membran SAC. Gör skiva i membranet SAC med skalpell och ta försiktigt bort huvudet av kyckling embryot.
- Snabbt halshugga huvudet med en sax.
- Placera spetsen på rakblad något bakre till och mellan ögonen. Gör en rostralt till stjärtfenan mittlinjen snitt genom skallen som endast lätt tryck *.
* Tips: trycket beror på ålder av embryot (dvs yngre = mindre, äldre = mer) - Tryck försiktigt åt sidan hud och fjädrar för att avslöja skallen och verifiera mittlinjen cut.
- Blockera rostralt delen av skallen genom skärning med ett rakblad. Placera bladet bakre ögonen och snabbt skära igenom hela skallen och hjärnvävnaden *.
* Tips: ett starkt tryck krävs för att helt ta bort rostralt avsnitt. - Gör mittlinjen till laterala snitt med en liten sax i caudal regionen i skallen, något anterior till synliga nackmusklerna på båda sidor av huvudet. Dra bort skallen och vävnad för att avslöja lillhjärnan och hjärnan.
- Ta försiktigt bort hjärnstammen från skallbasen genom att skära bifogade vävnad med en liten sax. När alla vävnad skärs bör hjärnstammen röra sig fritt från skallen *.
* Tips: Du kan behöva vända skallen (hjärnan ned) för att klippa bifogade vävnad.
4. Beredning av hjärnstammen för skivning
- När de avlägsnats från skallen, stift hjärnstammen ner genom synnerven tecta.
- Helt ta bort lillhjärnan genom att försiktigt skära blad med en liten sax, utsätta golvet i den fjärde ventrikeln.
- Ta bort alla membranös vävnad och blodkärl från ytan av hjärnstammen med pincett och göra laterala skär genom synnerven tecta att isolera hjärnstammen.
- Placera en liten mängd superlim på vibratome scenen framför agar blocket (mot vibratome bladet).
- Använda pincett, mjukt och snabbt lyfta hjärnstammen i ryggmärgen och placera vävnad på superlim med rostralt nedåt och dorsala sida mot att vibratome blad *.
* Tips: överflödigt lim ska absorberas med en kim-torka eller filterpapper innan nästa steg. - Häll försiktigt syresatt ACSF i vibratome scenen *.
* Obs: Denna ACSF kan kontinuerligt bubblade med O 2 / CO 2. Men bubblande av ACSF i en så liten volym lösning resulterar i oönskade rörelser (och eventuella skador) till hjärnstammen skivor. Om det utförs snabbt, redan syresatt ACSF från dissektion är tillräcklig. - Vibratome blad bör vara en 20-22 ° vinkel. Start vibratome (svängning bör fastställas till maximal amplitud) och flytta scenen upp mot bladet så att toppen av vävnad är parallell med bladet innan skivning.
- Snabbt flytta bladet mot hjärnstammen vävnad. Sakta ner kraftigt strax innan bladet kontakt med vävnad.
- Börja skära vävnad med lägsta möjliga framåt. När genom hela koronala delen av vävnad, rör försiktigt bit bort från bladet med en borste eller ett krossat glas, avfyrade polerat pipett passar i ena änden med en gummi glödlampa.
- Lägre steg i 300-500 ìm steg och skiva igen. Upprepa tills anatomiska signaturer är synliga i hjärnstammen vävnad. Vid denna tid, tjocklekar slice hjärnstammen vävnad som innehåller auditiva strukturer på 200-1000 ìm, beroende på ålder av vävnad och experimentell behov.
- Noggrant upprätthålla användbara skivor i ordningen skivning, dvs representerar den 1 skiva mest caudal regionen kretsen (lågfrekvent ljud bearbetning) och den sista skiva är den mest rostralt avsnitt (högfrekventa processing) *.
* Obs: för placering av skivor för kultur bruk, gå till avsnitt 6. För in-vitro fysiologi förvaring, se nästa avsnitt.
5. Skiva Förvaring för in-vitro fysiologi
- Beroende på ålder kyckling embryot och tjocklek på skiva, bör varje djur ge 1 till 6 skivor.
- Placera försiktigt enskilda sektorer i kammaren med hjälp av Fire Polished glaspipett monteras i ena änden med en gummi glödlampa. Avdelningen ska vara numrerade. Placera bara en skiva per brunn, för att behålla någon tonotopic specificitet (t.ex. de flesta stjärtfenan skiva i kammare 1 och den mest rostralt skiva i den sista kammaren). Avdelningen bör fyllas med ACSF och kontinuerligt bubblade med en blandning av 95% O 2 / 5% CO 2 (pH 7,4, osmolaritet 295-310 mOsm / l).
- Låt skivor att balansera genom att placera kammaren i ett varmt bad (36 ° C) i cirka 1 timme.
- Ta bort kammaren från varma bad och låt vila i rumstemperatur i ca ½ timme.
- Efter ½ timmar i rumstemperatur, kan skivor överföras från anläggningen kammaren till en ~ 0,5 ml inspelning kammare monterad på ett mikroskop för elektrofysiologiska experiment.
- Skivor kan användas för upp till ca 6 timmar efter borttagande från varmt bad.
6. Beredning av Organotypic Slice kulturer 8
- Omedelbart efter knivskärning förfarandet (se avsnitt 6) överföra skivor med ~ 500 mikroliter ACSF med en brand polerat glaspipett monteras i ena änden med en gummi glödlampa till en 48 brunnar på is. En skiva per brunn *.
* Tips: Slices måste vara minst 300 ìm och upp till 1000 ìm tjock. - Efter skivor har samlats in, överföra 48-brunnar till huven.
- Ta bort en 6-brunnar innehåller ur odlingssubstrat med inkubatorn och överföra den till huven.
- Strax före utsläppandet skivor från en enda hjärna på membran, en av det beredda membranet skären plats (se avsnitt 2.2) i en brunn med odlingsmedium. Se till att inga luftbubblor finns under membranet.
- Använda ett glas pipett en skiva i en droppe ACSF på kulturen membranet och ta bort överflödigt ACSF med en mikropipett. Upprepa för resterande skivor (max 4 skivor per membran) *.
* Tips: Se till att skivor inte kontakt med varandra och skivor plats centralt på membranet så att de inte vidrör membranet fälgen. - Upprepa för så många hjärnan skivor som behövs *.
* Tips: Om kulturer manipuleras vid en senare tidpunkt, kan det vara fördelaktigt att begränsa mängden av membran till 3 per 6-brunnar för att minska tiden kulturer tas bort från inkubatorn. - Ändra odlingsmedium 3 gånger i veckan under en huva: Avlägsna gammalt medium med ett vakuumrör med en steril spets när membranet sätter lyfts ur brunnen med en pincett. Tillsätt 1 ml färsk substratet i väl medan membranet sätter lyfts ur brunnen. När alla medel ändras, sätta tallriken tillbaka in i inkubatorn.
7. Representativa resultat:
Figur 1. Binaural kretsar av kyckling auditiva hjärnstammen. (A) Schematisk bild av en koronalt avsnitt och (BF) in vitro bilder bit av kycklingen auditiva hjärnstammen. Kretsen i (A) visar afferenta excitatoriska insatsvaror från hörselnerven (AN) till kärnan magnocellularis (NM) och kärnan angularis (NA). NM projekt bilaterala excitatoriska ingångar till kärnan laminaris (NL) på båda sidor av hjärnstammen. En hämmande input från den överlägsna olivary kärnan (SON) projekt till NA, NM och Nederländerna. Den in-vitro-skivor i (BF) är sekventiella bilder (200 ìm vardera) går från stjärtfenan (B) till rostralt (F) av kyckling auditiva hjärnstammen, som representerar låg-till hög frekvens regioner, respektive. Kretsar är ansvarig för kodning temporala egenskaper av ljud som används främst för ljudlokalisering. Skala bar i (B) = 500 ìm och gäller för bilder i (CF). Pilar i (D) visar på en enda cell kroppen lager av NL.
Figur 2. Odlade nervceller utvecklas normala fysiologiska svar egenskaper. Inspeglad förändringar membran spänning som svar på hyperpolarizing och depolariserande ström steg från akut (A & C) och odlade vävnaden vid 4 (B) och 7 (d) dagar i kultur (DIC). Notera förändringar i hyperpolarizing spänning "sag", stark minskning utåt nuvarande, och enda AP bränning som utvecklas på liknande sätt i segmentet kulturen metod jämfört med åldersmatchade motsvarande akut vävnad. Aktuell injektioner var 200 ms, i steg om 5-10 PA. RMPs var mellan -55 och -60 mV.
Figur 3. Anatomiska struktur i kultur SLICES. Vänster hälften av auditiva hjärnstammen av en E11 kyckling efter 7 dagar i kultur (DIC). En antikropp mot mikrotubuli-associerade proteiner 2 (MAP2), som uppstår i soma och dendriter, är märkta i grönt. Ett kluster av kärnan magnocellularis (NM) neuroner och axoner är märkta i rött via elektroporering av en Alexa dextran färgämne. Både NM och NL cellinje är synliga. Ipsilaterala NM Axon terminaler kan ses projicera på rygg NL dendriter (vit pilspetsar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under flera decennier har den akuta bit beredningen av kyckling hjärnstammen använts för att studera ljudbearbetning 9, 10. Detta tillvägagångssätt har gett en enorm mängd in vitro fysiologiska uppgifter om binaural behandling från både utvecklings-och mogna stater 4, 11, 12. Mycket är känt om detta mycket specialiserade krets och den roll varje kärna spelar i den temporala behandling av ljud 13, 14. I själva verket har kortsiktiga experimentella manipulationer och deras effekter på strukturen och funktionen av denna väldefinierad krets bevisad fördel 15. Ur ett långsiktigt utvecklingsperspektiv Sådana manipulationer är inte möjliga och tekniker för att behandla denna fråga är motiverade. Här föreslår vi en ny teknik som ger möjlighet att undersöka sådana frågor. Ytterst organotypic slice kulturer ger möjlighet att manipulera synaptisk aktivitet, inneboende regler kanal, postsynaptiska svar receptorn, och differentierad genexpression vid specifika och över långa utvecklings-perioder. Denna strategi kommer att bygga vidare på den omfattande kunskap om kyckling auditiva kretsen och bättre hjälpa forskarna att förstå grundläggande frågor om neurobiologiska utvecklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Nuvarande och tidigare Rubel lab medlemmar.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken ACSF | ||||
| NaCl | Fisher Scientific | M-11624 | 130 mM | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | M-10576 | 26 mM | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P-9333 | 3 mM | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S-8282 | 1.25 mM | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | 10 mM | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | 1 mM | |
| CaCl2 | Acros Organics | 423525000 | 2 mM | |
| Chicken culture medium (store at 4°C) | ||||
| advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate) | GIBCO, by Life Technologies | 12492-013 | 48.00% | |
| Earl’s balanced salt solution | Sigma-Aldrich | E-2888 | 24.00% | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma-Aldrich | G-7513 | 1.00% | |
| Glucose solution (200 g/l, sterile filtered) | Sigma-Aldrich | G-7528 | 2.75% | |
| horse serum (heat inactivated, sterile filtered) | Sigma-Aldrich | H-1138 | 24.00% | |
| Penicillin-streptomycin* | Sigma-Aldrich | P-0781 | 1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination |
|
| Specific equipment | ||||
| Millicell-CM cell culture inserts | PICMORG50 | EMD Millipore | ||
| 6-well plate | 6 Well Cell Culture Cluster | Corning | ||
| Incubator | Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific |
References
- Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents. J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).
- Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken. J Physiol. 540, 529-542 (2002).
- Gao, H., Lu, Y. Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons. Neuroscience. 153, 131-143 (2008).
- Sanchez, J. T., Wang, Y., Rubel, E. W., Barria, A. Development of glutamatergic synaptic transmission in binaural auditory neurons. J Neurophysiol. 104, 1774-1789 (2010).
- Jackson, H., Hackett, J. T., Rubel, E. W. Organization and development of brain stem auditory nuclei in the chick: ontogeny of postsynaptic responses. J Comp Neurol. 210, 80-86 (1982).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164, 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166, 469-489 (1976).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Reyes, A. D., Rubel, E. W., Spain, W. J. Membrane properties underlying the firing of neurons in the avian cochlear nucleus. J Neurosci. 14, 5352-5364 (1994).
- Monsivais, P., Rubel, E. W. Accommodation enhances depolarizing inhibition in central neurons. J Neurosci. 21, 7823-7830 (2001).
- Lu, T., Trussell, L. O. Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus. J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).
- Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).
- Trussell, L. O. Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways. Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).
- Trussell, L. O. Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons. Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).
- Sorensen, S. A., Rubel, E. W. The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure. J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).
