Summary
Tavuk işitsel beyin sapı Binoral ses işleme için sorumlu çekirdekleri oluşur. Kültürlü bir yaklaşım, nöron yapısı ve işitsel fonksiyonu, moleküler, hücresel ve ağ seviyelerinde gelişimini incelemek için eşsiz bir hazırlık sağlarken tek bir koronal dilim hazırlık tüm devre tutar.
Abstract
Tavuk işitsel beyin sapı, yaygın kalkınma 1-4 sağduyulu dönemlerde de, merkezi sinir sistemi 5-7 temporal kodlama için mekanizmaları gibi işitsel işleme anatomi ve fizyoloji çalışmak için kullanılan bir köklü bir model sistem.
Burada akut deneysel yöntemler ya da uzun vadeli deneysel manipülasyonlar için kültür Organotipik dilim kullanılabilir tavuk işitsel beyin sapı dilimleri hazırlamak için bir yöntem mevcut.
Tavuk işitsel beyin sapı, magnocellularis, laminaris ve üstün zeytin çekirdeği angularis oluşmaktadır. Bu çekirdeklerin Binoral ses işleme ve tek koronal dilim hazırlıkları tüm devreleri korumak için sorumludur. Sonuçta, Organotipik dilim kültürleri, sinaptik aktivite, pre ve postsinaptik bileşenler ifade, uyarılabilirlik ve diferansiyel gen ekspresyonu yönlerini kontrol ifade gibi çeşitli gelişimsel parametreleri işlemek için fırsat sağlayabilir
Bu yaklaşım, nöral devre geliştirme, arıtma ve olgunlaşma hakkında genel bilgi genişletmek için kullanılabilir.
Protocol
1. Alan Diseksiyon hazırlanması
- Kabarcık (pH 7,2-7,4 arasında, ozmolarite 295-310 mOsm / l)% 95 O 2 /% 5 CO2 karışımı ile sürekli yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF).
- ACSF köpürme iken,% 70 EtOH ile çalışma alanı temizleyin. Vibratome ve dilimleme bıçağı temizleyin. Distile su (dH 2 O) ile durulayın bıçak.
- Uygun kesme aletleri ile diseksiyon alanı temiz sıvı emilimi pedi yerleştirin.
- Tutkal vibratome-dilimleme odasının sahneye agar bloğu (40 mg agaroz dH 2 O / ml, yani% 4,) *.
* İpucu: diseksiyon önce agar hazırlamak. Buzdolabında kapalı bir petri içinde Mağaza önceden yapılmış agar. Agaroz Merck Kimyasallar veya Invitrogen satın aldı.
2. 6-Kültür ve Orta iyi Tabaklar hazırlanması
- Steril bir Kaputun altında, 1 ml kültür ortamı ve inkübe 35 ile 6 plaka hayvan başına 1 doldurmak ° C ve% 5 CO 2.
- Gerektiği gibi gibi birçok kültür membran ekler hazırlayın ve daha sonra kullanmak için bir başlık koyun.
3. Tavuk İşitsel Beyin Sapı, İzolasyon
- Yeri yumurta embriyo (genellikle yumurta büyük yan) hava dolu bir uzay boşluğu belirlemek için parlak bir ışık kaynağının altında.
- Membran kese açığa yumurta büyük bir tarafı açık kırın. Bistüri ile zar kese dilim olun ve tavuk embriyo baş hafifçe kaldırın.
- Hızla makasla başkanı başını kesmek.
- Yeri ve gözler arasında biraz arka jilet ucu. Sadece hafif bir basınç uygulayarak kafatası yoluyla bir rostral-kaudal orta hat insizyonu olun *.
* İpucu: uygulanan basınç, embriyonun yaşına bağlıdır (yani, genç = daha az, daha büyük = daha fazla) - Deri ve tüy, kafatası maruz ve orta hat kesme doğrulamak için yavaşça kenara itin.
- Bir jilet ile dilimleme kafatası rostral kısmı engelleyin. Gözleri posterior ve hızla tüm kafatası ve beyin dokusu kesti Pozisyon bıçak *.
* İpucu: güçlü bir baskı rostral bölümü tamamen kaldırmak için gereklidir. - Başın her iki tarafında görülebilir boyun kasları biraz ön kafatası kaudal bölgede küçük makas, orta hat-lateral insizyon olun. Kafatası ve maruz serebellum ve beyin doku dışarı doğru çekin.
- Bağlı doku, küçük makas ile keserek hafifçe kafa tabanı, beyin sapı çıkarın. Tüm doku kesilir sonra, beyin, kafatasının uzakta serbestçe hareket etmelidir *.
* İpucu: Eğer kafatası (beyin aşağı) bağlı doku kesmek için çevirmek gerekebilir.
4. Dilimleme için Beyinsapı hazırlanması
- Kafatası çıkarıldı, optik tecta aracılığıyla beyin sapı aşağı pin.
- Tamamen beyincik hafifçe peduncles, küçük bir makas ile kesme, dördüncü ventrikül zemin açığa çıkarın.
- Cımbız ile beyin yüzeyinde herhangi bir membranöz doku ve kan damarı çıkarın ve beyin sapı izole optik tecta ile yan keser.
- Agar bloğu önünde vibratome aşaması (vibratome bıçak doğru), süper yapıştırıcı küçük bir miktar koyun.
- Cımbız kullanarak, nazik ve hızla vibratome bıçak aşağı doğru rostral tarafında ve sırt tarafında, omurilik ve yer doku süper yapıştırıcı üzerine beyin sapı kaldırma *.
* İpucu: aşırı yapıştırıcı ile absorbe edilmelidir kim-silin ya da bir sonraki adım önce kağıt filtre. - Oksijenli ACSF vibratome aşamasında içine yavaşça dökün *.
* Not: Bu ACSF sürekli O 2 / CO 2 ile kabarmış olabilir. Ancak, beyin sapı dilim istenmeyen hareketi çözüm sonuçlarının gibi küçük bir hacim (ve olası hasar) ACSF, köpürme. Hızla gerçekleştirildiği takdirde, zaten diseksiyonu ACSF yeterli oksijenli. - Vibratome bıçak 20-22 ° açı olmalıdır. Başlangıç vibratome (salınım maksimum genlik set olması lazım) ve doku üst dilimleme önce bıçak ile paralel olacak şekilde bıçak doğru sahne yukarı taşımak.
- Beyin sapı doku hızla doğru bıçak taşıyın. , Doku ile bıçak temas ölçüde hemen önce yavaşlayın.
- Yavaş mümkün ileri hareket doku dilimleme başlayın. Tüm doku koronal bölümü aracılığıyla, nazik bir fırça ya da kırık bir cam dilim bıçak uzaklaşmaya, cilalı pipet lastik bir ampul ile bir ucunda uygun ateşledi.
- Alt 300-500 mikron adımları sahne ve tekrar dilim. Anatomik imzaları beyin sapı doku görünür olana kadar bu işlemi tekrarlayın. Şu anda, 200-1000 mm dilim beyin sapı işitsel yapıları içeren doku, doku ve deneysel ihtiyaçları yaşına bağlı olarak, kalınlıkları.
- Dikkatli bir şekilde korumak, yani dilimleme amacıyla kullanılabilir dilim 1. dilim devrenin en kaudal bölge (düşük frekanslı ses işleme) temsil eden ve son dilim en rostral bölümü (yüksek frekanslı processi temsil ederng) *.
* Not: kültür kullanmak için dilimleri yerleşim için, bölüm 6 gitmek. In-vitro fizyoloji depolama için, bir sonraki bölüme bakın.
5. In-vitro Fizyolojisi Dilim Depolama
- Her hayvan, tavuk embriyo ve dilim kalınlığı yaşına bağlı olarak 1 ila 6 dilim vermelidir.
- Yavaşça lastik bir ampul bir ucuna monte yangın parlatılmış cam pipet kullanarak odasında tek tek dilimleri yerleştirin. Odası numaralı olmalıdır. Bazı tonotopic özgüllük (örneğin, 1 kamara en kaudal dilim ve son odasında en rostral dilim) korumak için, yanı başına sadece bir dilim koyun. Odası ACSF ile dolu ve sürekli olarak% 95 O 2 /% 5 CO 2 (pH 7.4, ozmolarite 295-310 mOsm / l) oluşan bir karışım ile kabarmış olmalıdır.
- Dilimleri, yaklaşık 1 saat (36 ° C) ılık bir banyo odasının koyarak gelmesini sağlayınız.
- Ilık bir banyo odasının çıkartın ve oda sıcaklığında yaklaşık yarım saat dinlenmek için izin.
- Oda sıcaklığında yarım saat sonra, dilimler elektrofizyolojik deneyler için bir mikroskop üzerine monte ~ 0.5 mL kayıt odasına tutarak odasına transfer olabilir.
- Dilimler çıkarıldıktan sonra sıcak bir banyo ~ 6 saate kadar kullanılmış olabilir.
6. Organotipik Dilim Kültürler hazırlanması 8
- Hemen transferi dilim bir ucunda bir buz üzerinde 48 plaka bir kauçuk ampul takılmış yangın parlatılmış cam pipet kullanarak ~ 500 mcL ACSF dilimleme prosedürü izleyerek (bkz. Bölüm 6). Bir de her dilim *.
* İpucu: Dilimler, en az 300 mm ve 1000 mm kalınlığa kadar olması gerekir. - Dilimleri toplanmıştır sonra, kaput 48-plaka aktarın.
- 6-iyi bir kuluçka plaka içeren kültür ortamı dışarı çıkarın ve kaput transfer.
- Hemen önce iyi bir kültür ortamı ile (bkz. Bölüm 2.2), membranlar üzerine tek bir beyin dilimleri hazırlanan membran ekler birini yerleştirerek. Hiç hava kabarcığı membran altında bulunduğundan emin olun.
- Cam bir pipet kullanarak, bir dilim ACSF kültür membran üzerine bir damla transferi ve mikropipet aşırı ACSF kaldırmak. Kalan dilimleri için bu işlemi tekrarlayın (membran başına azami 4 dilim) *.
* İpucu: dilim membran jant dokunmayın böylece membran merkezi birbirine temas ve yer dilim yok emin olun. - Gerektiği gibi birçok beyin dilimleri için tekrarlayın *.
* İpucu: kültürler, daha sonraki bir zaman noktada manipüle Eğer kültürler inkübatör kaldırılır süresini azaltmak için, 6-plaka başına 3 membran miktarını sınırlamak için avantajlı olabilir. - Kültür ortamı haftada 3 kez bir başlık altında değiştir: membran eklemek iyi bir çift forseps kaldırdı ise, bir vakum tüp steril bir ucu eski orta çıkarın. Iyi membran eklemek iyi kaldırdı ise 1 ml taze kültür ortamı ekleyin. Tüm orta değiştirildiğinde, kuvöz içine arka plaka koymak.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. Tavuk işitsel beyin sapı Binaural devresi koronal bir bölümünün (A) Şematik ve tavuk işitsel beyin sapı (BF), in-vitro dilim görüntüler. (A) devre nükleus magnocellularis (NM) ve çekirdek angularis (NA) işitme siniri (AN) afferent eksitatör girişleri gösterir. NM nükleus laminaris (NL), beyin sapı her iki iki tarafında ikili eksitatör giriş projeler. NA, NM ve NL üstün olivary çekirdeği (SON) projeleri inhibitör giriş. De in-vitro dilimleri (BF), ardışık görüntüler yüksek frekans bölgelerinde düşük temsil kaudal (B) tavuk işitsel beyin sapı rostral (F) (her biri 200 mikron), sırasıyla . Devresi, öncelikle ses lokalizasyonu için kullanılan ses zamansal özellikleri kodlama için sorumludur. Ölçek çubuğu IN (B) = 500 mikron ve görüntüleri (CF) için de geçerlidir. NL, tek bir hücre gövdesi katmanı, (D) noktası oklar.
Şekil 2. Kültüre nöronların normal fizyolojik yanıtı özellikleri gelişir. Akut (A & C) ve 4 (B) ve 7 (D) kültürü gün (DIC) kültüre doku geçerli adımları hiperpolarizan ve depolarizan yanıt membran voltaj değişiklikleri süperempoze. Not yaş eşdeğer akut doku ile karşılaştırıldığında dilim kültür yaklaşımı benzer şekilde gelişir gerilim "sarkma", dışa akım güçlü bir azalma, tek bir AP ateş hiperpolarizan değişir. Şu enjeksiyonları 50-100 pA 200 ms, adımları. RMPs -55 ve -60 mV arasında idi.
Şekil 3. Kültür sli anatomik yapısıces E11 kültür 7 gün sonra bir tavuk (DIC), işitsel beyin sapı Sol yarısı. Soma ve dendritler oluşur mikrotübül ilişkili protein 2 (map2), karşı bir antikor, yeşil etiketli. Bir küme çekirdeği magnocellularis (NM) nöron ve aksonlar bir Alexa dekstran boya elektroporasyon yoluyla kırmızı olarak etiketlenir. NM ve NL hücre hattı her ikisi de görülebilir. Ipsilateral NM akson terminalleri dorsal NL dendritler (beyaz ok başları) için projelendirme görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birkaç on yıl için, akut dilim hazırlık tavuk beyin sapı işitsel işleme 9, 10 çalışma için kullanılır olmuştur. Bu yaklaşım, muazzam bir gelişim ve olgun hem de devletler 4, 11, 12 Binoral işleme in-vitro fizyolojik verilerin miktarı sağladı . Bu son derece özel bir devre ve her bir çekirdeği, 13, 14 ses temporal işleme oynadığı rol hakkında çok bilinir. Aslında, bu iyi karakterize bir devre yapısı ve işlevi, kısa vadeli deneysel manipülasyonlar ve etkileri avantajlı 15 kanıtlanmıştır. Ancak, uzun vadeli bir gelişim bakış açısıyla, bu tür manipülasyonlar mümkün değil ve bu sorunu gidermek için teknikler garantilidir. İşte biz bu soruları araştırmak için bir fırsat sağlayan yeni bir teknik önermek. Sonuçta, Organotipik dilim kültürleri özel ve üzerinde uzun gelişim dönemlerinde sinaptik aktivite, içsel kanal düzenlemeleri, postsinaptik reseptör yanıtları, ve diferansiyel gen ekspresyonu işlemek için umudu sağlar. Bu yaklaşım, daha kapsamlı bilgi tavuk işitsel devre üzerine inşa ve nörobiyolojik gelişimi hakkında temel soruları anlamada bilim adamları daha iyi yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Mevcut ve eski Rubel laboratuvar üyeleri.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken ACSF | ||||
| NaCl | Fisher Scientific | M-11624 | 130 mM | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | M-10576 | 26 mM | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P-9333 | 3 mM | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S-8282 | 1.25 mM | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | 10 mM | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | 1 mM | |
| CaCl2 | Acros Organics | 423525000 | 2 mM | |
| Chicken culture medium (store at 4°C) | ||||
| advanced minimum essential medium (with NEAA, sodium pyruvate at 110 mg/l, without L-glutamate) | GIBCO, by Life Technologies | 12492-013 | 48.00% | |
| Earl’s balanced salt solution | Sigma-Aldrich | E-2888 | 24.00% | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma-Aldrich | G-7513 | 1.00% | |
| Glucose solution (200 g/l, sterile filtered) | Sigma-Aldrich | G-7528 | 2.75% | |
| horse serum (heat inactivated, sterile filtered) | Sigma-Aldrich | H-1138 | 24.00% | |
| Penicillin-streptomycin* | Sigma-Aldrich | P-0781 | 1.00 ml * = Add to 100 ml culture medium if needed to prevent contamination |
|
| Specific equipment | ||||
| Millicell-CM cell culture inserts | PICMORG50 | EMD Millipore | ||
| 6-well plate | 6 Well Cell Culture Cluster | Corning | ||
| Incubator | Forma Scientific CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific |
References
- Howard, M. A., Burger, R. M., Rubel, E. W. A developmental switch to GABAergic inhibition dependent on increases in Kv1-type K+ currents. J Neurosci. 27, 2112-2123 (2007).
- Kuba, H., Koyano, K., Ohmori, H. Development of membrane conductance improves coincidence detection in the nucleus laminaris of the chicken. J Physiol. 540, 529-542 (2002).
- Gao, H., Lu, Y. Early development of intrinsic and synaptic properties of chicken nucleus laminaris neurons. Neuroscience. 153, 131-143 (2008).
- Sanchez, J. T., Wang, Y., Rubel, E. W., Barria, A. Development of glutamatergic synaptic transmission in binaural auditory neurons. J Neurophysiol. 104, 1774-1789 (2010).
- Jackson, H., Hackett, J. T., Rubel, E. W. Organization and development of brain stem auditory nuclei in the chick: ontogeny of postsynaptic responses. J Comp Neurol. 210, 80-86 (1982).
- Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164, 411-433 (1975).
- Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166, 469-489 (1976).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Reyes, A. D., Rubel, E. W., Spain, W. J. Membrane properties underlying the firing of neurons in the avian cochlear nucleus. J Neurosci. 14, 5352-5364 (1994).
- Monsivais, P., Rubel, E. W. Accommodation enhances depolarizing inhibition in central neurons. J Neurosci. 21, 7823-7830 (2001).
- Lu, T., Trussell, L. O. Development and elimination of endbulb synapses in the chick cochlear nucleus. J Neurosci. 27, 808-8017 (2007).
- Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. J Neurosci. 25, 1924-1934 (2005).
- Trussell, L. O. Cellular mechanisms for preservation of timing in central auditory pathways. Curr Opin Neurobiol. 7, 487-492 (1997).
- Trussell, L. O. Synaptic mechanisms for coding timing in auditory neurons. Annu Rev Physiol. 61, 477-496 (1999).
- Sorensen, S. A., Rubel, E. W. The level and integrity of synaptic input regulates dendrite structure. J Neurosci. 26, 1539-1550 (2006).
