Summary
مركز التجارة الدولية هو أداة قوية لدراسة الربط من يجند لمضيفه. في الأنظمة المعقدة ومع ذلك ، قد عدة نماذج تتناسب مع البيانات بشكل جيد على قدم المساواة. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة لتوضيح النموذج المناسب ملزمة للنظم المعقدة واستخراج المعلمات الحرارية المقابلة.
Abstract
ويشيع استخدام قياس الكالوري المعايرة متحاور (ITC) لتحديد معالم الحرارية المرتبطة ملزمة ليجند لجزيء المضيف. مركز التجارة الدولية لديها بعض المزايا على نهج مشترك لدراسة الطيفية المضيف / يجند التفاعلات. على سبيل المثال ، يتم قياس الحرارة بشكل مباشر أو امتصاصها سراح عنصرين عندما تتفاعل و لا يتطلب أي صحفيين الخارجية. وبالتالي يتم الحصول عليها بشكل مباشر على السخانة ملزمة وثابتة الجمعيات (كا) من بيانات مركز التجارة الدولية ، ويمكن استخدامها لحساب مساهمة التدهور الحتمي. علاوة على ذلك ، شكل الأيسوثرم يعتمد على القيمة ج الآلي ونموذج المشاركة. يتم تعريف القيمة ك ج ج = ن [ف] TKA ، حيث [ف] t هي تركيز البروتين ، و n هو عدد من المواقع داخل ملزم يجند المضيف. في كثير من الحالات ، ومواقع متعددة لملزم يجند المعطاة هي غير متكافئة ومركز التجارة الدولية تسمح للتوصيف المعلمات ملزم الحرارية لموقع ملزمة لكل فرد. لكن هذا يتطلب أن يتم استخدام النموذج الصحيح ملزمة. هذا الخيار يمكن أن يكون مشكلة إذا كان يمكن احتواء نماذج مختلفة على نفس البيانات التجريبية. لقد أظهرنا سابقا أن هذه المشكلة يمكن التحايل عليها إجراء التجارب في العديد من القيم ، ج. وتناسب الأيسوثرم متعددة حصلت في مختلف ج قيم في نفس الوقت إلى نماذج منفصلة. يتم تعريف النموذج الصحيح المقبلة على أساس من التوافق الخير عبر ورقة العمل متغيرة ج بأكمله. يتم تطبيق هذه العملية هنا إلى أمينوغليكوزيد المقاومة المسببة للأمينوغليكوزيد انزيم - N - 6' أسيتيل - II (AAC (6 ') - II). على الرغم من أن لدينا منهجية تنطبق على أي نظام ، ويتجلى على نحو أفضل ضرورة هذه الاستراتيجية مع نظام جزيء ، أو يجند تظهر allostery cooperativity ، وعندما تقدم نماذج مختلفة تناسب ملزمة أساسا مطابقة لنفس البيانات. على حد علمنا ، لا توجد مثل هذه النظم المتاحة تجاريا. الجميح للسيارات (6 ') ، الجزء الثاني ، هو هومو ديمر تحتوي على موقعين النشطة ، والتي تبين cooperativity بين مفارز اثنين. ومع ذلك ، يمكن الحصول على بيانات مركز التجارة الدولية في واحدة من طراز C - قيمة يكون لائقا أيضا بالتساوي على اثنين على الاقل من نماذج مختلفة نموذجا اثنين من مجموعات من مواقع مستقلة وثنائية موقع متسلسل النموذج (التعاونية). ج من خلال متفاوتة القيمة كما هو موضح أعلاه ، ثبت أن النموذج الصحيح ملزمة لالجميح للسيارات (6 ') ، الثاني هو نموذج ثنائي موقع ملزمة متسلسلة. هنا ، نحن تصف الخطوات التي يجب اتخاذها عند إجراء التجارب في مركز التجارة الدولية من أجل الحصول على مجموعات البيانات المناسبة للمتغير ج التحليلات.
Protocol
1. إعداد الحلول الأسهم
- تنقية جزيء من الفائدة. (وفي هذه الحالة ، يتم عزل أمينوغليكوزيد - N - 6' أسيتيل - II (AAC6' - II) ، كما ذكرت في مكان آخر. 13)
- 4 لترات من إعداد العازلة لغسيل الكلى. (في هذه الحالة كنا 25 ملم 4 -- (2 - هيدروكسي إيثيل) - 1 - piperazineethanesulfonic حمض (HEPES ، 238.3 ميغاواط ز / مول) ، التي تحتوي على حمض 2 ملي ethylenediaminetetraacetic (EDTA ، 292.2 ميغاواط) ، في الرقم الهيدروجيني 7.5.)
- Dialyze البروتين و(6 ') AAC - II نموذج (5 مل بسعر 400 ميكرومتر) المستخدمة يجب مدال العازلة في غسيل الكلى (3 × 1.3 لتر). يبقى الحل النهائي لشطف الغسيل آلة لتخفيف والعينات.
- مرشح الحل النهائي غسيل الكلى من خلال مرشح ميكرومتر السليلوز 0.45 ، وتخزينها في 4 درجة مئوية. وسوف يشار إليها باسم "تشغيل العازلة"
- حل تصفية البروتين من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر التي تم تشطف جيدا مع العازلة على التوالي. قياس تركيز النهائي من البروتين باستخدام مقايسة القياسية (برادفورد ، لوري ، الخ) أو الامتصاصية للأشعة فوق البنفسجية. تخزين البروتين لتحقيق أقصى قدر من الاستقرار على المدى الطويل. (وفي حالة AAC (6 ') ، الجزء الثاني ، وهذا يعني تخزين في 4 درجات مئوية. AAC (6') - II لا تحتفظ النشاط بعد تجميد والذوبان).
- إعداد 200μL من 25 ملم من محلول المخزون وأنزيم أسيتيل (AcCoA ، ويجند ، 809.57 ميجاوات) عن طريق إذابة 4.0 ملغ في تشغيل العازلة. التجميد في -78 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
- يجب على كل من البروتين وعينات يجند حلول تنبع من نفس الرصيد ، للحد من عينة عشوائية العينة إلى التقلبات في التركيز. يتم ضبط عامل واحد لتصحيح تركيز البروتين عبر كامل مجموعة البيانات متغير ج في التحليل. 10
2. عينات المركز بإعداد
- تمييع الحل انزيم إلى القيمة من 64 ج مع الحجم النهائي من 2 مل. (وفي حالة AAC (6 ') - II ، وهذا يتوافق إلى 192 ميكرومتر).
- ذوبان الجليد بسرعة حل يجند الأسهم (AcCoA) في الماء المثلج.
- إعداد 0.5 مل من محلول AcCoA 10 مرات أكثر تركيزا ثم عدد من المواقع ملزمة للبروتين ، في هذه الحالة 4 ملم ، عن طريق تمييع 80 ميكرولتر من محلول المخزون AcCoA في 420 ميليلتر من تشغيل المخزن المؤقت. نقل في أنبوب ملء ماصة. عودة بسرعة إلى حل الأسهم AcCoA -78 درجة مئوية.
- ديغا البروتين والحلول في ظل فراغ لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 1 درجة مئوية تحت درجة حرارة التشغيل المطلوبة (19 درجة مئوية).
3. إعداد الحقنة 14
- إدراج حقن حقنة حقنة من خلال حامل حتى المشبك حقنة قبل شنت هو على نفس الارتفاع حامل.
- تغذية المشبك حقنة الثاني على حقن حقنة حتى يتم الضغط بقوة ضد أسفل حامل المحاقن. تشديد بلطف المشبك مع توفير 0.050 محرك بول "الهيكس نقطة.
- صاحب مكان الحقنة في حامل ماصة.
- الشريحة بلطف حاقن ماصة في حقنة الحقن. تأكد من تغذية رأس الغطاس مباشرة في حفرة من الحقنة. بمجرد إدراجها بشكل كامل ، المسمار قلادة تأمين صاحب حقنة في حاقن ماصة.
4. تحميل خلية العينة 14
- غسل خلية العينة مع حد أدنى من 50 مل من تشغيل المخزن ، وإزالة أي السائل المتبقية باستخدام طويلة اذعا زجاج 2.5 مل حقنة.
- رسم ببطء الحد الأدنى من 1.8 مل من محلول البروتين في عينة نظيفة وجافة طويلة اذعا حقنة مل 2.5. يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات.
- إدراج بعناية في الخلية عينة الإبرة واللمس بلطف أسفل الخلية. رفع الطرف قليلا (~ 1 ملم) وحقن بلطف AAC (6 ') - II حل في الخلية حتى السائل الزائد مرئيا فوق الجزء العلوي من الخلية العينة.
- رفع ببطء الإبرة حوالي 1 سم مع ضمان يبقى السائل في تجاوز. الانسحاب بسرعة وحقن كمية صغيرة من محلول (~ 0.25 مل) لإزالة أي فقاعات المحاصرين في خلية العينة.
- إزالة كل تجاوز الحل. ويتم تحقيق هذا عن طريق تحريك الإبرة بلطف جنبا الى جنب مع من تجاوز في الخلية العينة. غيض حقنة سوف تصل على الحافة ، وهذا هو ذروة الرغبة في حل قيد التشغيل. إزالة كافة السائل الذي يجلس فوق هذا الخط.
5. تحميل حقن حقنة والشروع في تشغيل 14
- إرفاق تحميل أنبوب بلاستيكي حقنة بمنفذ التعبئة.
- أقل تلميح المكبس إلى أعلى سد المنفذ.
- وضع حل AcCoA في أنبوب ملء ماصة في الجزء السفلي من حامل ماصة. ينبغي للطرف الحقنة عدم لمس الجزء السفلي من أنبوب الملء.
- رسم ببطء الحل في حقنة حتى كمية صغيرة يدخل أنبوب المحقنة التحميل.
- إغلاق المنفذ ملء بتخفيض رأس المكبس وانقر على زر إغلاق ميناء التعبئة. تطهير والملء ، وذلك بالنقر على إزالة -> زر تعبئة ، و 3 مرات لإزالة أي فقاعات الهواء التي قد أصبحوا محاصرين أثناء التحميل.
- إزالة أنبوب الملء من حامل ماصة ويمسح برفق طرف الحقنة.
- أخذ حقنة ماصة التجمع وأقل برفق داخل الخلية العينة. المضي قدما ببطء والحقنة يمكن ينحني بسهولة ، لذلك هناك حاجة إلى عناية كبيرة. ضمان إدراج تماما الحقنة عن طريق الضغط باستمرار على قاعدة تأمين ذوي الياقات البيضاء.
- ضبط درجة الحرارة المطلوبة تعمل (في هذه الحالة 20 درجة مئوية) ، وتحديد مرجعية السلطة التي هي أكبر قليلا من تدفق حقن الحرارة القصوى المتوقعة (في هذه الحالة 20μcal/sec).
- برنامج حقن كميات المطلوبة والتأخير. (وفي هذه الحالة ، تم توظيف 28 عن طريق الحقن. الحقنة الأولى كان حجم 2 ميكرولتر مع تأخير 60 ق. جميع الحقن التي تلت تلك الكميات من 10 ميكرولتر مع التأخير 330 ق.)
6. تشغيل اللاحقة
- يعمل في كل لاحقة كرر الخطوات 2-5 ، بينما تتناقص AAC (6 ') ثانيا ، وتركيزات AcCoA بعامل 2،4،8،16 ، و 32.
7. تحليل البيانات
- استخدام الإجراء المناسب الذي يناسب العالم كافة الأيسوثرم لمجموعة واحدة من المعلمات ملزم ، كما هو موضح سابقا 10.
8. ممثل النتائج
وتظهر بيانات تمثيلية في الشكل 1. وينبغي أن الأشكال من الأيسوثرم تختلف مع التركيز. ومن المتوقع حدة التحولات لأعلى قيم ج (أي أعلى من البروتين وتركيزات يجند) (الشكل 2).
في حالة AAC (6 ') ، الجزء الثاني ، نموذج ثنائي موقع متسلسل يعطي أفضل من واحد يصلح اصفا مجموعتين من المواقع ، ومتطابقة مع stoichiometries مستقلة قابلة للتعديل.
الشكل 1. الأيسوثرم المعايرة التي تنتجها من AcCoA (3.86 ملم) في الجميح للسيارات (6 ') - II (192 ميكرومتر). أ) تتبع المركز الخام. ب) القيم المتكاملة المستخدمة لتحديد المعلمات ملزم (المربعات) مع نوبة 2 - موقع متسلسل (--).
الشكل 2. الأيسوثرم مركز التجارة الدولية لAcCoA معاير في الجميح للسيارات (6 ') - II بتركيزات متفاوتة. واحتواء البيانات التجريبية (الدوائر المغلقة) إلى نموذج مستقل 2 مجموعات من بين المواقع (أرجواني متقطع) ونموذج 2 - موقع متسلسل (الأزرق الصلبة). نموذج 2 - موقع sequentional يعطي بوضوح اتفاق شامل على نحو أفضل. كانت التركيزات المستخدمة A) 6 ميكرومتر ، 0.25 ملم ، B) 12 ميكرومتر ، 0.25 ملم ، C) 24 ميكرومتر ، و 0.5 مم ، D) 48 ميكرومتر ، 1.0 مم ، E) 96 ميكرومتر ، 1.9 ملم ، وواو) 196 ميكرومتر ، 3.86 ملم ، لAAC (6 ') - II وAcCoA على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد كان هذا الجزء التحليلي من متغير ج تركيب سبق وصفها بالتفصيل 10. نحن هنا التقرير الجوانب العملية لجمع قواعد البيانات متغيرة ج مناسبة لهذا النهج. فمن الضروري أن يتم سحب جميع البروتين وعينات من يجند حلول بنفس الرصيد. ولذلك فمن المهم أن يتم تحضير محلول المخزون كاف في البداية لإكمال سلسلة كاملة من التجارب. هذا يضمن نسبة AAC (6 ') - II وAcCoA مستمر بين جميع التجارب ، ويقلل من التقلبات العشوائية في التركيز على أساس العينة إلى عينة.
في هذه الحالة ، يجب توخي الحذر في التعامل مع الكثير من يجند. AcCoA غير مستقر كيميائيا في الحل ولذلك فمن الضروري أن الحل لا يزال السائل المخزون لفترات قصيرة جدا من الزمن. بمجرد aliquoted كمية مناسبة من محلول المخزون ، المخزون يجب أن يكون على الفور refrozen. إذا لم يتم ذلك ، ثم قد AcCoA تتحلل بمرور الوقت وتركيزات لن تكون صحيحة في يدير لاحقا. مرة واحدة aliquoted ، يجب استخدام العينات AcCoA على الفور. في حالة البروتينات التي هي غير مستقرة ، وسوف يكون من الضروري احتياطات مماثلة.
هذا الإجراء يمكن تعديلها بسهولة لدراسة النظم المعقدة الأخرى ، ويجب أن تتكيف 10 التركيزات المستخدمة لثوابت ملزمة للنظام محدد. مطلوب مجموعة واسعة من القيم ج بين 1 و 1000 حوالي 8،10 في ورقة العمل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) ، الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) ، ومنحة دراسية للتدريب CIHR (لLF). نشكر الأستاذ جيرار دي رايت (جامعة ماكماستر ، كندا) لالجميح للسيارات (6) - II التعبير البلازميد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl c–nzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | 7365-45-9 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | |
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | |
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR international | 281445-477 | |
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman, GE Healthcare | 7184-004 | |
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
References
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. ksana, J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. ITC Data Analysis in Origin. , 7 edn, MicroCal. (2004).
