Virochip एक अखिल वायरल साथ – साथ संरक्षित अनुक्रम समरूपता के आधार पर सभी ज्ञात के रूप में अच्छी तरह के रूप में वायरस उपन्यास वायरस का पता लगाने के लिए डिज़ाइन माइक्रोएरे है. यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे एक Virochip परख चलाने के लिए दोनों ज्ञात और अज्ञात वायरस की उपस्थिति के लिए नैदानिक नमूनों का विश्लेषण.
कई संक्रामक रोगों के वायरल कारणों के निदान के वायरस के निहित अनुक्रम विविधता के रूप में अच्छी तरह के रूप में सार्स coronavirus और 2009 महामारी H1N1 इन्फ्लूएंजा वायरस, कि पारंपरिक तरीकों के द्वारा detectable नहीं कर रहे हैं जैसे उपन्यास वायरल रोगज़नक़ों, के चल रहे उद्भव के कारण मुश्किल है. इन चुनौतियों से निपटने के के लिए, हम पहले और विकसित किया है एक माइक्रोएरे संरक्षित अनुक्रम 1 समरूपता के आधार पर सभी ज्ञात के रूप में अच्छी तरह के रूप में वायरस उपन्यास वेरिएंट का पता लगाने की क्षमता के साथ अखिल वायरल Virochip बुलाया मंच पुष्टि. Virochip का उपयोग करना, हम अस्पताल में भर्ती रोगियों में अस्पष्टीकृत गंभीर बीमारी के मामलों सहित श्वसन संक्रमण, एक के बराबर या पारंपरिक चिकित्सीय परीक्षण 2-5 के लिए बेहतर संवेदनशीलता के साथ, के साथ जुड़े वायरस का पूरा स्पेक्ट्रम की पहचान की है. Virochip भी उपन्यास वायरस सार्स coronavirus 6,7, एक उपन्यास rhinovirus 5 क्लेड, XMRV (एक प्रोस्टेट कैंसर से जुड़े retrovirus) 8, एवियन (तोते में एक बर्बाद कर रोग का कारण) bornavirus 9 सहित, की पहचान किया गया है, और श्वसन और 10 अतिसारीय बीमारी के साथ बच्चों में एक उपन्यास cardiovirus है. Virochip के वर्तमान संस्करण एक Agilent माइक्रोएरे मंच रखी है और ~ +३६,००० 2009 के दिसंबर के रूप में ~ अधिक GenBank में 1500 वायरस से निकाली गई जांच के होते हैं. यहाँ हम शुरू से ही एक Virochip परख प्रसंस्करण में शामिल चरणों (~ 24 घंटे प्रतिवर्तन समय) नमूना न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, पीसीआर प्रवर्धन यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग, फ्लोरोसेंट रंजक समावेश, और माइक्रोएरे संकरण, स्कैनिंग, और विश्लेषण सहित खत्म प्रदर्शित करता है.
Virochip के रूप में यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल जटिल है और एक जटिल और कुशल अनुसंधान तकनीशियन की आवश्यकता है. सही अभिकर्मक सांद्रता और पीसीआर, लेबलिंग के लिए शर्तों, और संकरण महत्वपूर्ण हैं. Virochip प्रोटोकॉल आसानी से रोगग्रस्त ऊतकों के न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए TRIzol (Invitrogen) के रूप में एक ऊतक निष्कर्षण विधि के उपयोग से विश्लेषण को समायोजित करने के लिए संशोधित कर सकते हैं. जांच या जोड़ा जा सकता है वांछित स्पेक्ट्रम और कवरेज की चौड़ाई प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में नष्ट कर दिया है, उदाहरण के लिए, जैसे जीवाणु और कवक nonviral लक्ष्य का पता लगाने के के लिए जांच और डिजाइन किया जा सकता है "मक्खी पर" जोड़ा. विकास के अंतर्गत वर्तमान Virochip परख के कुछ अनुप्रयोगों के नैदानिक प्रयोगशाला, प्रकोप की जांच, दवाओं और टीकों की शुद्धता स्क्रीनिंग, और उपन्यास वायरल रोगज़नक़ खोज में व्यापक स्पेक्ट्रम वायरल निदान शामिल हैं.
The authors have nothing to disclose.
हम प्रारंभिक और Virochip प्रोटोकॉल के विकास के अनुकूलन के लिए डेविड वैंग, अनातोली Urisman, एमी Kistler, Kael फिशर, पैट्रिक तांग, और अलेक्जेंडर Greninger धन्यवाद. यह काम एक NIH K08 अनुदान और Abbott डिस्कवरी पुरस्कार (सीसी के लिए) और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (JLD के लिए) द्वारा समर्थित है.
Name of reagent / material | Name of reagent / material |
---|---|
PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
1 μL water | |
0.5 μL 0.1M DTT | |
0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
3.8 μL water | |
0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
1 μL 100 pmol / μL primer B | |
1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
37 μL water | |
Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
1 μL 100 pmol / μL primer B | |
1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
37 μL water | |
Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
Add water to total volume of 25 μL | |
Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |