Summary
कैसे niches और स्टेम कोशिकाओं के विकास के दौरान फार्म व्यावहारिक निहितार्थ के साथ एक महत्वपूर्ण सवाल है. में
Protocol
1. बिछाने अंडे
- विच्छेदन के पांच दिन पहले: mated महिलाओं ताजा खमीर के साथ पूरक भोजन पर 2-4 घंटे के लिए अंडे देना करने के लिए अनुमति देते हैं. सिंक्रनाइज़ और अच्छी तरह से विकसित लार्वा को मिलता है, यह महत्वपूर्ण है के लिए भीड़ नहीं है सभ्य (के बारे में 30 अंडे / 25mm शीशी). आमतौर पर, 7-16 महिलाओं को प्रति शीशी उपयोग किया जाता है, कितनी अच्छी तरह वे करना पर निर्भर करता है.
2. लार्वा का चयन
- 9 अच्छी तरह से एक गिलास विदारक घंटी मध्यम (128mM NaCl, 2mm KCL, 1.8mm 2 CaCl, 4mm 2 MgCl, 35.5mM Sucrose, 5mm Hepes पीएच 6.9) के साथ भरा पकवान तैयार है.
- एक छह अच्छी तरह से घंटी मध्यम और यह बर्फ पर जगह युक्त थाली में सेल strainers तैयार करें. वैकल्पिक रूप से, हम विशेष रूप से बनाया एक नायलॉन जाल के साथ फिट molds का उपयोग करें.
- शीशी ठीक जैविक चिमटी (संदंश) का उपयोग कर दीवारों से समय लार्वा उठाओ और घंटी युक्त विदारक डिश में उन्हें जगह.
- एक अच्छी तरह से साफ करने के लिए एक महिला लार्वा स्थानांतरण. हम अपने gonads द्वारा पुरुषों से महिलाओं को भेद. पुरुष testes आसानी से बड़े स्पष्ट वसा शरीर के पीछे तीसरे में एम्बेडेड ovals के रूप में पहचाने जाते हैं. महिला के अंडाशय, वसा शरीर के एक ही भाग में स्थित है, एक बहुत छोटे, स्पष्ट, गोल क्षेत्रों के रूप में पहचाना जा सकता है.
3. लार्वा के विच्छेदन
- नीचे सिर्फ संदंश के साथ मस्तिष्क को पीछे लार्वा पकड़ो और संदंश के एक दूसरे जोड़ी के साथ सिर हटाने.
- पृष्ठीय पक्ष पर शेष पीछे भाग ट्रेकिआ नीचे का सामना करना पड़ के साथ रखें.
- संदंश की एक जोड़ी के साथ पीछे spiracles द्वारा लार्वा पकड़ो और यह आवक धीरे धीरे धक्का जबकि दूसरी जोड़ी छल्ली पीछे फिसलने है जब तक के बारे में आधा लार्वा वसा शरीर उभर.
- मजबूती पीछे छोर पकड़ और संदंश के अन्य जोड़ी का उपयोग करने के लिए शिथिल छल्ली पकड़. धीरे से और धीरे धीरे दूर पीछे अंत खींच तो और अंतराल के माध्यम से संलग्न आंत स्लाइड छल्ली कि. इस प्रक्रिया के अंत में, वसा शरीर पूरी तरह से आंत और छल्ली से अलग होना चाहिए. आंत वसा शरीर के पूर्वकाल भाग से डिस्कनेक्ट. धुंधला हो जाना और आसान बढ़ते बनाने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि वसा शरीर बरकरार रहेगा.
- एक अच्छी तरह से युक्त dissected लार्वा से अधिमानतः घंटी मध्यम के साथ एक चराई अच्छी तरह पिपेट, गीले. यह विंदुक कोट में मदद करता है और यह करने के लिए चिपके से वसा शरीर को रोकता है. चरागाह विंदुक प्रयोग सेल झरनी में बर्फ के ठंडे घंटी मध्यम में वसा शरीर हस्तांतरण.
4. फिक्सेशन और धुंधला
कमरे के तापमान पर सभी चरणों का प्रदर्शन कर रहे हैं, पहली एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के अलावा 4 डिग्री सेल्सियस
- घंटी मध्यम में 5% formaldehyde में वसा शरीर को सेते हैं. कोमल आंदोलन के साथ 20 मिनट के लिए.
- 1% (1% पीबीएस में ट्राइटन x 100) पीबीटी के साथ 5 मिनट के लिए धोएं. 10 मिनट और 45 मिनट के लिए एक तीसरी बार के लिए यह कदम दोहराएँ. % 1 ट्राइटन X-100 लार्वा अंडाशय छेदना और एंटीबॉडी यह घुसना करने की अनुमति की आवश्यकता है.
- कोमल आंदोलन के साथ एक घंटे के लिए 0.3% (0.3% Triton एक्स 100 और पीबीएस में 1% BSA) PBTB के साथ ब्लॉक
- वांछित 1 सेंट 4 बजे रात से अधिक 0.3% PBTB में पतला एंटीबॉडी ° सी कोमल आंदोलन के साथ साथ सेते हैं. यह कदम आम तौर पर एक रोलर पर 0.2 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रदर्शन किया.
- वसा शरीर को वापस स्थानांतरण सेल strainers.
- कोमल आंदोलन के साथ 0.3% PBTB के साथ 3 बार, 30 मिनट प्रत्येक, धो लें.
- 0.3% PBTB कोमल आंदोलन के साथ एक घंटे के लिए 5% सामान्य गधा सीरम के साथ पूरक के साथ ब्लॉक.
- एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान की (0.3% 5% 0.3% पीबीटी में सामान्य गधा सीरम के साथ पूरक PBTB) में (निर्माता की विनिर्देश के अनुसार) कोमल आंदोलन के साथ 2 घंटे के लिए पतला के साथ सेते हैं. यदि एंटीबॉडी फ्लोरोसेंट है, अंधेरे में इस बिंदु से आगे सेते हैं. यह कदम आम तौर पर एक रोलर पर 0.2 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रदर्शन किया.
- 30 प्रत्येक कोमल आंदोलन के साथ 0.3% पीबीटी के साथ मिनट के लिए 3 बार धोएं.
5. बढ़ते
- एक साफ Eppendorf ट्यूब वसा शरीर स्थानांतरण. बहुत ध्यान से सभी तरल पदार्थ दूर हटाने और तुरंत Vectashield बढ़ते मीडिया के साथ कवर. हम vectashield नियमित इस्तेमाल के बाद से यह कठोर नहीं है जबकि अंडाशय वसा शरीर से अलग हो रहे हैं किया जा रहा है.
नमूने 4 ° C में बढ़ते मीडिया में संग्रहीत किया जा सकता है एक सप्ताह के लिए. - एक विंदुक टिप के अंत कट और इसका इस्तेमाल ध्यान से बढ़ते मीडिया की न्यूनतम मात्रा (एक 30mm कवर पर्ची के लिए 30 μl के बारे में) के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड पर वसा शरीर हस्तांतरण.
- दो मढ़वाया निकेल पिन धारकों का उपयोग करें, 0.1 मिमी व्यास पिन पकड़े वसा शरीर में फैल. अंडाशय वसा शरीर के पीछे तीसरे स्थान पर स्थित हैं. वसा शरीर है कि उन्हें चारों ओर आम तौर पर एक 'फूल' की तरह आकार का है. यह अंडाशय के स्थान की पहचान करने में मदद करता है. वसा शरीर के बाकी हिस्सों से 'फूल' काटना और बाद त्यागें.
- वसा शरीर surro निकालेंइसके चारों ओर ध्यान दो पिनों पार करके जननपिंड unding. वसा शरीर के अवशेषों से दूर स्लाइड पर अलग जननपिंड रखें.
- एक कवर और नेल पॉलिश के साथ पर्ची सील के साथ कवर.
- कल्पना सीधे एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर. नमूने 4 ° C में संग्रहीत किया जा सकता है, के लिए तीन सप्ताह के लिए लिए.
6. प्रतिनिधि परिणाम
हम ऊपर प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है दैहिक अंडाशय के भीतर कई सेल प्रजातियों GSCs और उनके दैहिक niches के सहित, की स्थापना का पालन करें. इस प्रयोजन के लिए हम विशिष्ट एंटीबॉडी और मार्कर का उपयोग करने के लिए विकासशील जननपिंड में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच भेद. यहाँ हम दो LL3 एंटीबॉडी के विभिन्न संयोजनों के साथ दाग अंडाशय का एक उदाहरण दिखाते हैं. चित्रा 1A टर्मिनल रेशा और टोपी कोशिकाओं (हरा), जो एक साथ दैहिक कोशिकाओं के आला फार्म पर प्रकाश डाला गया. चित्रा 1B, intermingled कोशिकाओं (आईसीएस, Magenta) है, जो सीधे जर्म कोशिकाओं (नीला) से संपर्क दिखाता है.
चित्रा 1 LL3 अंडाशय. (ए) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1B1 (मैजंटा) दैहिक कोशिकाओं और दाग fusome, PGCs भीतर एक intracellular organelle (तीर) की रूपरेखा. बढ़ाने hh-lacZ जाल (β-galactosidase विरोधी, हरा) टर्मिनल filaments में व्यक्त किया है. रेशा दैहिक टोपी कोशिकाओं (arrowheads) के आधार पर देखा जा सकता है है. (बी) 1B1 एंटीबॉडी (हरा) अंडाशय में सभी दैहिक कोशिकाओं की रूपरेखा. विरोधी वासा (नीला) सभी PGCs लेबल. PGCs सीधे intermingled कोशिकाओं (आईसीएस, विरोधी ट्रैफिक जाम, Magenta,) से संपर्क करें. बार (ए और बी के लिए) 20 सुक्ष्ममापी है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस वीडियो में एक अलगाव और देर तीसरे instar लार्वा अंडाशय के धुंधला प्रोटोकॉल को दर्शाता है. इस प्रोटोकॉल नियमित रूप से और मज़बूती से प्रदर्शन करने के लिए, निम्नलिखित बातों को ध्यान भुगतान किया जाना चाहिए:
- सिंक्रनाइज़ और अच्छी तरह से विकसित लार्वा के लिए, अधिक भीड़ से बचा जाना चाहिए.
- छोटे पारभासी अंडाशय के नुकसान से बचने के लिए, वसा शरीर को बरकरार काटना सुनिश्चित करें. यह भी बढ़ते चरण में अंडाशय का पता लगाने में मदद करेंगे, खासकर जब छोटे (दूसरे या तीसरे instar की शुरुआत) अंडाशय बढ़ते.
- आदेश में एक समय में कई नमूने को संभालने के लिए, सेल strainers या अन्य contraptions का उपयोग करें.
- यकीन है कि कभी नहीं सूखी नमूने.
- हम बढ़ते स्तर के लिए एक अच्छा स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. एक तरफा अंधेरे के साथ प्रेषित प्रकाश आधार का उपयोग दायर हम स्थितियों जहां पारभासी अंडाशय और सफेद वसा शरीर के बीच के विपरीत यह अंडाशय खोजने के लिए और हेरफेर करने के लिए आसान बनाता है.
- बढ़ते के बाद, दोहराया तापमान परिवर्तन से बचने, यह एंटीबॉडी के पृथक्करण का कारण बनता है और धुंधला की गुणवत्ता को कम कर देता है.
इस प्रोटोकॉल पहले लार्वा चरणों के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन वसा शरीर के और अधिक नाजुक और stickier है, जो यह कुछ हद तक और अधिक जटिल बना देता है. यह सबसे अच्छा है देर तीसरे instar पहला dissections अभ्यास.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
आईएम मैरी क्यूरी पुनः एकीकरण अनुदान द्वारा समर्थित है. यह काम इसराइल विज्ञान कोष अनुदान नहीं द्वारा समर्थित किया गया था. 1146-1108, हेलेन और के Weizmann विज्ञान संस्थान में स्टेम सेल अनुसंधान और Leir चैरिटेबल फाउंडेशन के लिए मार्टिन Kimmel संस्थान द्वारा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sucrose | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nickel plated pin holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | Corning | 7220-85 | |
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica Microsystems | ||
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| Slides | Menzel-Glaser | 798 | |
| Cover slips | Corning | 2940-223 | |
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | |
| Cell strainer | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | ||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
