Summary
틈새와 줄기 세포를 개발하는 동안 양식 얼마나 실용적인 의미가있는 중요한 질문이다. 에
Abstract
많은 기관 embryogenesis 동안에 성인 생활 동안 유지 보수 또는 수리를 위해 자신의 개발을위한 줄기 세포에 따라 달라집니다. 그들이 환경과 상호 작용하는 방법에 줄기 세포 형태, 방법을 이해하는 것은 개발, 항상성 및 질병을 이해 그러므로 매우 중요합니다. 과일 파리 Drosophila melanogaster의 난소는 체세포 지원 전지 (틈새) 1, 2와 세균 라인 줄기 세포 (GSCs)의 상호 작용에 대한 영향력 모델로 재직하고 있습니다. 유전자를 조작하는 능력을 결합 틈새와 GSCs의 알려진 위치, 줄기 세포와 그 틈새 3-12 사이의 상호 작용의 다양한 명료하게하다하는 연구자를 허용하고 있습니다.
GSC 유지 및 분화를 조절하는 메커니즘에 대한 정보의 풍부한에도 불구하고, 상대적으로 조금은 GSCs 및 체세포의 틈새 시장 개발 중에 양식 방법에 대한 알려져있다. 그의 세포 컴포넌트 단자 필라멘트와 캡 세포 (그림 1), 세 번째 애벌레 instar 13-17 동안 양식을 포함 약 18 체세포의 틈새. GSCs는 원시 배아 세포 (PGCs)에서 발생한. PGCs 일찍 애벌레 단계에서 세포 분열 따위에 의해 번식하지만 틈새의 형성 다음 PGCs의 하급 집단은 GSCs 7, 16, 18, 19이됩니다. 함께, 체세포의 틈새 세포와 GSCs은 유기체의 일생 동안 계란을 생산하는 기능 단위를합니다.
GSC 단위의 형성에 관한 많은 질문도 답이 남아 있습니다. 이러한 전구체 틈새와 줄기 세포 엽 성의 전구 물질에 대한 세포, 또는 그들이 GSCs가로의가 PGCs 내에서 비대칭 세대 간의 조정하는 프로세스는 최고의 유충에서 공부하실 수 있습니다. 그러나 애벌레 난소 개발 방식 연구 물리적으로 도전합니다. 첫째, 애벌레 난소 작은 수 있습니다. 비록 늦은 애벌레 단계에서 그들은 전반에만 100μm 수 있습니다. 또한, 난소 투명하고 하얀 지방이 신체에 박혀있다. 여기 형광 항체와 얼룩 다음 늦은 세번째 instar (LL3) Drosophila의 유충에서 난소를 분리를위한 단계별 절차를 설명합니다. 우리는, 난소의 위치를 침몰하지 티슈 얼룩 및 세척하고, 항체가 조직에 침투되었는지 확인하는 등의 문제 몇 가지 기술적인 솔루션을 제공합니다. 이 프로토콜은 이전의 애벌레 단계와뿐만 아니라 애벌레 testes에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 부설 에그
- 해부 - 5 일 : 성관계 여성은 효모와 보충 신선한 음식 2~4시간에 대한 알을 낳을 수 있습니다. 에 동기와 잘 개발 애벌레를, 그것이 중요하다 콩나물도하지 양식 (약 30 알 / 25mm 유리병). 일반적으로 7-16 여자들은 누워 얼마나 잘 따라 유리병마다 사용됩니다.
2. 애벌레 선택
- 링어의 중간 (128mM NaCl, 2mM Kcl, 1.8mM CaCl 2, MgCl 4mm짜리 2, 35.5mM 자당, 5mM Hepes의 산도 6.9)로 가득한 9 잘 유리 해부 접시를 준비합니다.
- 링어의 중간 얼음에 장소를 포함하는 여섯 잘 플레이트의 세포 strainers를 준비합니다. 또한, 우리는 나일론 메쉬가 장착되어 특별히 만든 금형을 사용합니다.
- 고급 생물 학적 핀셋 (포셉)를 사용하여 유리 벽면에서 시간이 초과되었습니다 애벌레를 선택하고 링거스 포함 해부 접시에 놓으십시오.
- 깨끗한 잘하는 여성 유충을 전송합니다. 우리가 그들의 생식선으로 남성에서 여성을 구분합니다. 남성 testes 쉽게 지방 신체의 뒷부분 세번째에 포함된 빅 클리어 타원으로 식별됩니다. 지방 신체의 같은 부분에 위치한 여성 난소는, 훨씬 작고, 분명히 둥근 분야로 확인할 수 있습니다.
3. 유충의 해부
- 포셉과 두뇌로 단지 사후 유충 잡고 포셉의 두 번째 쌍의과 머리를 제거합니다.
- 기관이 아래로 향하게하여, 등의 측면에 나머지 후부 부분을 넣으십시오.
- 포셉 한 쌍의와 사후 spiracles하여 유충을 잡고 절반에 해당하는 애벌레 지방 기관이 나온다 때까지 다른 한쌍은 뒤로 표피를 압박할 수있는 동안 안으로 천천히 밀어.
- 단단히 뒷부분 끝을 잡고 느슨하게 표피를 잡아 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 부드럽게 천천히 후부 끝부분을 끌어낼의 격차를 통해 표피와 연결된 소장 슬라이드 있도록. 이 과정의 끝에, 지방 시체가 완전히 소장 및 표피에서 분리해야합니다. 지방 신체의 앞쪽에 부분에서 대장을 분리합니다. 얼룩 쉽게 장착을 만들려면, 그것은 지방이 몸 그대로 유지됩니다 것이 중요합니다.
- 선호 잘 포함 해부 애벌레에서 링어의 중간과 함께 철저하게 파스투레 피펫 젖었어. 이 외투 피펫 도움과를 지키는에서 지방 시체를 방지할 수 있습니다. 셀 스트레이너에 얼음 차가운 링어의 중간에 지방 시체를 전송하는 파스투레 피펫을 사용합니다.
4. 고정 및 스테 이닝
모든 단계 4에서 처음으로 항체와 부화를 제외하고, 상온에서 수행됩니다 ° C.
- 링어의 중간에 5 %의 포름 알데히드에 지방 시체를 품어. 부드러운 교반과 함께 20 분.
- 1% PBT (1 % 트리톤 PBS에서 X - 100) 5 분 씻으십시오. 10 분이 단계 45 분 세 번째를 반복합니다. 1퍼센트 트리톤 X - 100은 애벌레 난소를 구멍과 항체가 그것을 뚫을 수 있도록해야합니다.
- 부드러운 교반 1 시간 동안 0.3 % PBTB (0.3 % 트리톤 X - 100과 PBS에 1 % BSA)로 차단
- 4 박 이상 0.3 % PBTB에 희석 원하는 1 일 항체 ° 부드러운 동요와 C와 부화. 이 단계는 일반적으로 롤러에 0.2 ML 튜브에서 수행됩니다.
- 셀 strainers 다시 지방 시신을 전송합니다.
- 부드러운 교반과 함께 0.3 % PBTB 3 회 30 분 각각을 씻으십시오.
- 부드러운 교반 1 시간 동안 5% 정상 당나귀 혈청 보충 0.3 % PBTB로 차단합니다.
- 적절한 보조 항체 부드러운 교반 2 시간 동안 차단 솔루션 (0.3 % PBT에서 5% 정상 당나귀 혈청과 보충 0.3 % PBTB)에 (제조 업체의 사양에 따라) 희석과 부화. 항체가 형광 경우이 시점 이후부터 어둠 속에 품어. 이 단계는 일반적으로 롤러에 0.2 ML 튜브에서 수행됩니다.
- 삼십분 각 부드러운 동요와 0.3 % PBT와 3 번 씻으십시오.
5. 설치
- 깨끗한 eppendorf 튜브에 지방 시체를 전송합니다. 매우 신중하게 떨어져 모든 액체를 제거하고 즉시 Vectashield 장착 미디어 커버. 난소가 지방 신체에서 분리되고있는 동안은 강화하지 않기 때문에 우리는 정기적으로 vectashield를 사용합니다.
최대 일주일까지 샘플 4 ° C에서 장착 매체에 저장할 수 있습니다. - 피펫 팁의 끝을 잘라 조심스럽게 현미경 슬라이드에 장착 미디어의 최소한의 볼륨 (30mm 커버 - 미끄럼 30 μl에 대한)와 지방 몸을 전송로를 사용합니다.
- 지방 시체를 밖으로 확산 0.1 mm 직경의 핀을 잡고, 두 니켈 도금 핀 홀더를 사용하십시오. 난소는 지방 신체의 뒷부분 세번째에 위치하고 있습니다. 그들을 둘러싸고 지방 시체는 일반적으로 '꽃'과 같은 모양입니다. 이것은 난소의 위치를 파악하는 데 도움을줍니다. 지방 신체의 나머지 부분에서 '꽃'을 밖으로 해부하다하고 후자를 폐기하십시오.
- 지방 신체 surro을 제거주위 조심스럽게 두 개의 핀을 교차하여 생식선을 unding. 멀리 지방 바디 잔여물에서 슬라이드에 고립 생식선를 놓습니다.
- 매니큐어와 표지 전표 날인과 함께 표지.
- 공촛점 현미경을 사용하여 직접 시각화. 샘플은 최대 3 주 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
6. 대표 결과
우리는 GSCs과 체세포의 틈새를 포함한 체세포의 난소 안에 여러 개의 세포 lineages의 설립에 따라 위의 프로토콜을 사용하고 있습니다. 이러한 목적을 위해 우리는 개발 생식선에있는 다른 세포 유형 간의 구분하는 구체적인 항체와 마커를 사용합니다. 여기 항체의 다른 조합을 물들일이 LL3 난소의 예를 보여줍니다. 그림 1A 함께 틈새 시장의 체세포를 형성 터미널 필라멘트 및 캡 세포 (녹색)를 강조 표시합니다. 그림 1B는 직접 세균 세포 (파란색)에 연락 혼합된 세포 (ICS, 마젠타), 보여줍니다.
그림 1. LL3 난소. (A) 단클론 항체 1B1 (마젠타)는 체세포와 얼룩 fusome을 PGCs 이내 세포내 organelle을 (화살표) 설명합니다. 향상제 트랩 HH - lacZ (β - galactosidase 방지, 녹색)이 터미널 필라멘트에 표시됩니다. 필라멘트 체세포 캡 세포 (화살촉)의 기지에서 볼 수 있습니다. (B) 1B1 항체 (녹색)은 난소의 모든 체세포를 설명합니다. 안티 바사 (파란색)은 모든 PGCs를 표시합니다. PGCs 직접 혼합된 세포 (ICS, 안티 교통 체증, 마젠타)에게 문의하십시오. 바 (A와 B에 대한) 20 μm의 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 비디오는 후반 세번째 instar 애벌레의 난소의 격리 및 얼룩 프로토콜을 보여줍니다. 일상적으로 안정이 프로토콜을 수행하려면, 관심은 다음 사항에 지불되어야합니다
- 동기화 및 잘 발달 애벌레의 경우, 이상의 크롤 링은 피해야합니다.
- 작은 반투명 난소의 손실을 피하기 위해 지방 몸이 그대로 해부하다에 있는지 확인하십시오. 이것은 (두 번째 혹은 세 instar의 시작) 이하 난소를 장착 특히, 장착 단계에서 난소를 찾는데 도움이 될 것입니다.
- 한 번에 많은 샘플을 처리하기 위해 셀 strainers 또는 기타 contraptions을 사용합니다.
- 샘플 건조 절대 있는지 확인하십시오.
- 우리는 설치 단계에 대한 스테레오 현미경 좋은을 사용합니다. 일방적인 어둠이 빛을 전송 기반을 사용하면 반투명 난소와 하얀 지방이 신체의 대비가 난소를 찾아서 조작으로 쉽게 어디에 우리가 조건을 찾을 수 제기했다.
- 설치에 따라 반복되는 온도 변화를 피하,이 항체의 분리의 원인과 얼룩의 품질을 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜은 이전의 애벌레 단계에 적용하지만, 지방 신체는 다소 더 복잡하게하는 더 연약하고 stickier 수있다. 늦은 세번째 instar 먼저 해부 연습을하는 것이 좋습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
IM은 마리 퀴리 다시 통합 교부금에 의해 지원됩니다. 이 작품은 이스라엘 과학 기금 부여 번호에 의해 지원되었다. 1146년부터 1108년까지, 헬렌과 줄기 세포 과학의 웨이즈만 연구소에서 연구 및 레어 자선 재단 마틴 킴멀 연구소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sucrose | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nickel plated pin holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | Corning | 7220-85 | |
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica Microsystems | ||
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| Slides | Menzel-Glaser | 798 | |
| Cover slips | Corning | 2940-223 | |
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | |
| Cell strainer | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | ||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
