Summary
壁龛和干细胞如何在发展过程中形成的，是一个具有实际意义的重要问题。在
Abstract
许多器官取决于其发展的干细胞，胚胎发育过程中和在成年生活中的保养或维修。因此，了解如何干细胞的形式，以及如何与环境互动的了解发展，动态平衡和疾病的关键。曾担任果蝇卵巢生殖系干细胞与他们的躯体支持细胞（利基）1，2（GSCs）的相互作用的一个有影响力的模型。的利基和GSCs已知的位置，再加上基因操纵他们的能力，使研究人员阐明了各种干细胞及其龛3-12之间的相互作用。
尽管控制GSC维护和分化机制的信息财富，相对鲜为人知的是，如何GSCs和他们的体龛在发展过程中形成。约18体龛，其细胞成分，包括终端长丝和帽细胞（图1），在第三幼虫龄 13-17形式。 GSCs源于原始生殖细胞（PGCs）。 PGCS增殖早期幼虫阶段，但形成的利基的PGCS分组成为GSCs 7，16，18，19。总之，体利基细胞的GSCs一个功能单位，生产鸡蛋整个生物体的寿命。
就形成的GSC单位许多问题仍然悬而未决。如壁龛和干细胞前体的前体细胞，或代内PGCS不对称，因为他们成为GSCs之间的协调过程，最好是能在幼虫研究。然而，有条不紊幼虫卵巢发育的研究是身体具有挑战性。首先，幼虫卵巢小。即使在后期幼体阶段，他们只有100μm的跨越。此外，卵巢是透明的，嵌入在白色脂肪组织。在这里，我们描述一个孤立晚三龄（LL3） 果蝇幼虫，用荧光抗体染色，卵巢的一步一步的协议。我们提供了一些问题，如定位卵巢，染色和洗涤不下沉的组织，确保抗体渗透到组织的技术解决方案。该协议可应用于早期幼虫期和幼虫睾丸以及。
Protocol
1。产卵
- 5天前清扫：允许交配女性躺在鸡蛋2-4个小时，用酵母补充的新鲜食品。为了得到同步和发达的幼虫，重要的是不要有人满为患培养（约30卵/25毫米瓶）。通常情况下，每小瓶7-16女性，取决于他们躺在。
2。选择幼虫
- 准备9以及玻璃，夹层菜充满林格氏液（128毫米氯化钠，2MM KCL，1.8MM，4MM氯化钙氯化镁 2，35.5mM蔗糖，5MM HEPES pH值6.9） 。
- 准备在6孔林格的中期和它放在冰盘细胞过滤器。另外，我们用一个尼龙网装上特制的模具。
- 选择使用罚款（钳）生物镊子从小瓶墙壁定时幼虫和林格含解剖菜。
- 一名女幼虫转移到一个干净的井。我们区别于其性腺男性的女性。男性睾丸很容易识别嵌入在脂肪体后的第三大明确椭圆。女性卵巢，位于肥胖的身体的同一部分，可以被认定为一个更小的，明确的，全面领域。
3。剖析幼虫
- 保持幼虫仅下跌后大脑与钳和删除的第二双钳头。
- 广场上的背侧后剩余的部分，气管朝下。
- 握住一双镊子后气孔的幼虫，然后向内推缓慢而另一对角质层向后滑动，直到大约一半的幼虫的脂肪体出现。
- 牢牢把握的后部，使用产钳的另一对松散举行的角质层。轻轻地，慢慢地绝尘而去后，使差距的角质层，并通过附加肠道幻灯片。在这个过程结束时，应完全分离，脂肪体，从肠道内和角质层。肠道脂肪体前部断开。为了使染色和安装容易，重要的是，肥胖的身体将保持不变。
- 湿与林格中型牧场吸管彻底，最好是从一个含有解剖幼虫。这有助于大衣移液器和防止肥胖的身体，从坚持它。使用牧场吸管转移到肥胖的身体在冰冷的林格氏细胞过滤器中的介质。
4。固定和染色
所有步骤都是在室温下进行，除了第一抗体的潜伏期，在4 ° C。
- 孵育5％甲醛林格的中期脂肪体。轻轻摇动20分钟。
- 用1％的PBT（1％的Triton X - 100的PBS）洗5分钟。重复此步骤10分钟和45分钟的第三次。 1％的Triton X - 100的穿孔幼虫的卵巢和允许抗体渗透。
- PBTB 0.3％（0.3％的Triton X - 100和1％的牛血清白蛋白的PBS）为1小时，轻轻摇动座
- 所需的第一抗体在0.3％，超过晚上PBTB稀释后在4 °与轻轻摇动孵育。这一步通常在0.2毫升管上滚。
- 转移脂肪体细胞过滤器。
- 洗3次，每次30分钟，轻轻摇动PBTB 0.3％。
- 与0.3％，5％的正常驴血清轻轻摇动1小时补充PBTB座。
- 孵育一个适当的二级抗体稀释于封闭液（0.3％与5％，0.3％，PBT的正常驴血清补充PBTB）（根据制造商的规范）为2小时，轻轻摇动。如果抗体荧光，在黑暗从这个点开始孵化。这一步通常在0.2毫升管上滚。
- 洗3次，每次30分钟，用0.3％轻轻摇动PBT。
5。安装
- 脂肪体转移到一个干净的Eppendorf管中。非常小心地取出所有的液体，立即盖上Vectashield安装媒体。我们经常使用vectashield因为它不会变硬，而卵巢被脂肪体分离。
样品可以保存在4 ° C长达一个星期的安装媒体。 - 剪下一个枪头，并用它来仔细安装媒体的最小量（约30μL为30毫米的覆盖防滑）转移到载玻片的脂肪体。
- 使用镀镍针持有人，持有直径0.1毫米引脚摊开肥胖的身体。卵巢是位于后三分之一的肥胖的身体。他们周围的脂肪体，通常是形如一个“花”。这有助于确定卵巢的位置。解剖出肥胖的身体的其余部分的“花朵”，并放弃后者。
- 去除脂肪的身体surrounding仔细越过它周围的两个引脚性腺。将在幻灯片上，远离脂肪体残留的孤立性腺。
- 盖上盖玻片，指甲油密封。
- 可视化直接使用共聚焦显微镜。样品可以保存在4 ° C至三个星期。
6。代表性的成果
我们已经使用了上述协议，按照建立体卵巢内的细胞谱系，包括GSCs和他们的体龛。为此，我们使用的特异性抗体和标记以区分不同类型的细胞在发展中国家性腺。在这里，我们显示的两个LL3染卵巢抗体的不同组合例子。图1A突出终端长丝和帽细胞（绿色），它们共同形成的利基体细胞。图1B，显示混合细胞（ICS，洋红），直接接触生殖细胞（蓝色）。
图1。LL3卵巢。 （一）单克隆抗体1B1（洋红色），概述了体细胞和污渍fusome，内PGCS细胞内的细胞器（箭头）。陷阱HH - lacZ的增强（抗β-半乳糖苷酶，绿色）表示在终端的细丝。在基地的丝体第细胞（箭头）可以观察到。 （二）1B1抗体（绿色）列出所有的体细胞在卵巢。反瓦萨（蓝色）标签所有PGCS。 PGCS直接接触（集成电路，反堵车，洋红）的混合细胞。酒吧（A和B）是20微米。
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Discussion
本视频演示晚三龄幼虫卵巢的隔离和染色协议。要经常和可靠地执行这一协议，应注意以下几点：
- 同步和发达的幼虫，较拥挤，必须避免。
- 为了避免损失小的半透明卵巢，确保解剖脂肪体完好无损。这也将有助于在安装阶段的定位卵巢，尤其是当安装年轻（第二或第三龄开始）卵巢。
- 为了同时处理很多样品，使用细胞过滤器或其他的玩意儿。
- 确保永不干涸的样本。
- 我们使用一个很好的立体显微镜安装阶段。使用片面黑暗透射光基础提起半透明的卵巢和白色脂肪组织之间的对比度可以很容易找到和操纵卵巢的，我们可以发现条件。
- 下列安装，避免反复的温度变化，这会导致抗体的分离和减少染色质量。
该协议可应用于早期幼虫阶段，但肥胖的身体是比较脆弱，粘性的，这使得它比较复杂。这是最好的实践晚第三龄第一解剖。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
IM是由居里夫人重新整合的赠款支持。这项工作是由以色列科学基金资助没有的支持。 1146年至1108年，由海伦和马丁金梅尔在魏茨曼科学研究所的干细胞研究和Leir慈善基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sucrose | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nickel plated pin holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | Corning | 7220-85 | |
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica Microsystems | ||
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| Slides | Menzel-Glaser | 798 | |
| Cover slips | Corning | 2940-223 | |
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | |
| Cell strainer | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | ||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
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