Summary
Wie Nischen und Stammzellen während der Entwicklung bilden eine wichtige Frage mit praktischen Auswirkungen. Im
Abstract
Viele Organe sind abhängig von Stammzellen für ihre Entwicklung während der Embryogenese und zur Wartung oder Reparatur im Erwachsenenalter. Zu verstehen, wie Stammzellen zu bilden, und wie sie mit ihrer Umwelt interagieren, ist daher von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Entwicklung, Homöostase und Krankheit. Der Eierstock der Fruchtfliege Drosophila melanogaster als ein einflussreiches Modell für das Zusammenwirken von Keimbahn-Stammzellen (GSCS) mit ihren somatischen Stützzellen (Nischen-) 1, 2 serviert. Die bekannte Position der Nische und die GSCS, gekoppelt mit der Fähigkeit, genetisch zu manipulieren, ist Forschern erlaubt, eine Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und ihren Nischen 3-12 aufzuklären.
Trotz der Fülle von Informationen über Mechanismen, die GSC Wartung und Differenzierung, ist relativ wenig darüber, wie GSCS und ihre somatischen Nischen bilden während der Entwicklung bekannt. Etwa 18 somatische Nischen, deren zelluläre Komponenten umfassen Terminal Filament-und cap-Zellen (Abbildung 1) bilden im dritten Larvenstadium 13-17. GSCS stammen aus primordialen Keimzellen (PGC). PGCs wuchern in den frühen Larvenstadien, aber nach der Bildung der Nische eine Untergruppe von PGCs wird GSCS 7, 16, 18, 19. Zusammen bilden die somatischen Zellen Nische und die GSCS eine funktionelle Einheit, die Eier produziert während der gesamten Lebensdauer des Organismus.
Viele Fragen bezüglich der Bildung der GSC-Einheit bleiben unbeantwortet. Prozesse wie die Koordinierung zwischen Vorläuferzellen für Nischen und Stammzell-Vorstufen, oder die Erzeugung der Asymmetrie innerhalb PGCs, wie sie GSCS werden, lässt sich am besten in der Larve untersucht werden. Allerdings ist eine methodische Untersuchung der Larven Eierstock Entwicklung körperlich anspruchsvoll. Erstens sind Larven Eierstöcke klein. Selbst am späten Larvenstadien sind sie nur 100 um across. Darüber hinaus werden die Eierstöcke transparent und werden in einem weißen Fett eingebettet. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von Eierstöcken von späten dritten Larvenstadium (LL3) Drosophila-Larven, durch Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern. Wir bieten einige technische Lösungen für Probleme wie das Auffinden der Eierstöcke, Färbung und Waschen Gewebe, die nicht untergehen, und sicherzustellen, dass Antikörper in das Gewebe eindringen. Dieses Protokoll kann zu früheren Larvenstadien und Larven Hoden als auch angewandt werden.
Protocol
1. Eiablage
- Fünf Tage vor ihrer Zerlegung: allow begatteten Weibchen die Eier für 2-4 Stunden auf frische Lebensmittel mit Hefe ergänzt legen. Um synchronisiert und gut entwickelte Larven, ist es wichtig, nicht zu überfüllt sind kultiviert (ca. 30 Eier / 25mm Durchstechflasche). Typischerweise werden 7-16 Weibchen pro Fläschchen verwendet, je nachdem, wie gut sie lag.
2. Die Auswahl Larven
- Bereiten Sie eine 9-sowie Glas Sezieren Schale mit Ringer-Medium (128mm NaCl, 2 mM KCl, 1,8 CaCl 2, 4 mm MgCl 2, 35,5 mm Saccharose, 5 mM Hepes pH 6,9) gefüllt.
- Bereiten Zelle Siebe in einem Sechs-Well-Platte mit Ringer-Medium und stellen Sie ihn auf Eis. Alternativ verwenden wir speziell angefertigte Formen mit einer Nylon-Mesh ausgestattet.
- Pick-timed Larven von Fläschchen Wände mit feinen biologischen Pinzetten (Pinzette) und legen Sie sie in die Ringer-mit Sezieren Gericht.
- Übertragen einer weiblichen Larve, um eine saubere gut. Wir unterscheiden Weibchen von Männchen durch ihre Keimdrüsen. Männliche Hoden sind einfach so groß klar Ovale in das hintere Drittel des Fettes eingebettet identifiziert. Weiblichen Eierstöcken, gleichzeitig ein Teil des Fettes Körpers befindet, kann als eine viel kleinere, klar, rund Sphären identifiziert werden.
3. Dissection der Larve
- Halten Sie die Larve sich unmittelbar hinter dem Gehirn mit einer Pinzette und entfernen Sie den Kopf mit einer zweiten Pinzette.
- Die restlichen hinteren Teil auf der Rückenseite, mit der Luftröhre nach unten.
- Halten Sie die Larve durch die hinteren Luftlöcher mit einer Pinzette und schieben Sie ihn nach innen langsam, während das andere Paar gleitet die Nagelhaut hinten, bis etwa die Hälfte der Larven fetten Körper entsteht.
- Halten Sie das hintere Ende und mit der anderen Pinzette zu locker halten die Schuppenschicht. Langsam und vorsichtig wegziehen hinteren Ende, so dass die Kutikula und der beigefügten Darm schieben durch den Spalt. Am Ende dieses Prozesses sollten die fetten Körper vollständig aus dem Darm und die Kutikula getrennt werden. Trennen Sie den Darm aus dem vorderen Teil der fetten Körper. Um Fleckenbildung und Montage zu erleichtern, ist es wichtig, dass die fetten Körper intakt bleibt.
- Wet einer Weide Pipette gründlich mit Ringer-Medium, vorzugsweise aus einem Brunnen mit seziert Larven. Dies hilft Mantel der Pipette und verhindert, dass die fetten Körper hängen bleibt. Verwenden Sie die Weide Pipette auf die fetten Körper in die eiskalte Ringerlösung Medium in die Zelle Sieb übertragen.
4. Fixierung und Färbung
Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, mit Ausnahme der Inkubation mit dem ersten Antikörper, bei 4 ° C.
- Inkubieren Sie die fetten Körper in 5% Formaldehyd in Ringer-Medium. für 20 Minuten unter leichtem Schütteln.
- Wash für 5 Minuten mit 1% PBT (1% Triton x-100 in PBS). Wiederholen Sie diesen Schritt für 10 Minuten und ein drittes Mal für 45 Minuten. 1% Triton X-100 ist erforderlich, um die Larven Eierstock perforieren und damit ausreichend Antikörper gegen sie zu durchdringen.
- Block mit 0,3% PBTB (0,3% Triton x-100 und 1% BSA in PBS) für 1 Stunde unter leichtem Schütteln
- Inkubieren mit dem gewünschten 1 st Antikörper in 0,3% PBTB über Nacht bei 4 ° C verdünnt unter leichtem Schütteln. Dieser Schritt ist in der Regel in 0,2 ml Röhrchen auf einem Rollenprüfstand durchgeführt.
- Transfer fetten Körper zurück zu Zelle Siebe.
- 3 x waschen, jeweils 30 Minuten, mit 0,3% PBTB unter leichtem Schütteln.
- Block mit 0,3% PBTB mit 5% normalem Esel-Serum für 1 Stunde unter leichtem Schütteln ergänzt.
- Inkubieren mit einem geeigneten sekundären Antikörper verdünnt (nach Herstellerangaben) in Blocking-Lösung (0,3% PBTB mit 5% normalem Esel-Serum in 0,3% PBT ergänzt) für 2 Stunden unter leichtem Schütteln. Wenn der Antikörper ist fluoreszierend, in der Dunkelheit ab diesem Zeitpunkt zu inkubieren. Dieser Schritt ist in der Regel in 0,2 ml Röhrchen auf einem Rollenprüfstand durchgeführt.
- Wash 3 mal für jeweils 30 Minuten mit 0,3% PBT unter leichtem Schütteln.
5. Montage
- Übertragen Sie die fetten Körper, um eine saubere Eppendorf-Röhrchen. Sehr vorsichtig alle Flüssigkeiten entfernt und sofort mit Vectashield Montage Medien abdecken. Wir verwenden Vectashield routinemäßig, da sie nicht verhärten, während die Eierstöcke aus dem fetten Körper getrennt sind.
Die Proben können bei der Montage Medien bei 4 ° C gelagert werden bis zu einer Woche. - Schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze und verwenden Sie es sorgfältig zu überweisen Sie den fetten Körper mit minimalem Volumen von Montage-Medien (etwa 30 ul für einen 30mm Deckglas) auf einen Objektträger.
- Verwenden Sie zwei vernickelten Pin-Halter, hält 0,1 mm Durchmesser Stifte, um sich auszubreiten die fetten Körper. Die Eierstöcke sind an der hinteren Drittel der fetten Körper entfernt. Die fetten Körper, die sie umgibt, ist in der Regel wie eine "Blume" geprägt. Dies hilft bei der Identifizierung der Lage der Eierstöcke. Sezieren die "Blumen" aus dem Rest der fetten Körper und entsorgen Sie diese.
- Entfernen Sie die fetten Körper Surrounding der Gonade durch Kreuzung der beiden Stifte vorsichtig um ihn herum. Legen Sie die isoliert Gonade auf der Folie von der fetten Körper Rückstand.
- Abdeckung mit einem Deckglas und Dichtung mit Nagellack.
- Visualisieren Sie direkt mit einem konfokalen Mikroskop. Die Proben können bei 4 ° C gelagert werden bis zu drei Wochen.
6. Repräsentative Ergebnisse
Wir haben die oben genannten Protokoll verwendet, um die Einrichtung mehrerer Zelllinien im Rahmen der somatischen Eierstock, darunter GSCS und ihre somatischen Nischen folgen. Zu diesem Zweck verwenden wir spezifische Antikörper und Marker, um zwischen den verschiedenen Zelltypen in den Entwicklungsländern Gonade zu unterscheiden. Hier zeigen wir ein Beispiel von zwei LL3 Eierstöcke mit verschiedenen Kombinationen von Antikörpern gefärbt. Abbildung 1A Highlights Terminal Filament-und cap-Zellen (grün), die zusammen die somatischen Zellen der Nische. Abbildung 1B zeigt die vermischten Zellen (ICs, magenta), die direkt an Keimzellen (blau).
Abbildung 1. LL3 Eierstöcke. (A) monoklonale Antikörper 1B1 (magenta) skizziert somatischen Zellen und färbt die fusome, einem intrazellulären Organellen innerhalb PGCs (Pfeile). Die Enhancer-trap hh-lacZ (anti β-Galactosidase, Grün) befindet sich im Terminal Filamente ausgedrückt. An der Basis des Filaments somatischen Zellen Kappe (Pfeilspitzen) beobachtet werden können. (B) 1B1-Antikörper (grün) beschreibt alle somatischen Zellen in den Eierstöcken. Anti-Vasa (blau) Etiketten aller PGCs. PGCs direkt an den vermischten Zellen (ICs, Anti-Stau, magenta). Bar (für A und B) ist 20 um.
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Discussion
Dieses Video zeigt eine Isolation und Färbeprotokoll des späten dritten Larvenstadium Larven Eierstöcke. Um dieses Protokoll regelmäßig und zuverlässig, sollten ihr Augenmerk auf die folgenden Punkte beachtet werden:
- Für synchronisiert und gut entwickelte Larven, muss über Verdrängung vermieden werden.
- Zur Vermeidung von Verlust der kleine, durchsichtige Eierstöcke, stellen Sie sicher, sezieren die fetten Körper intakt. Dies wird auch bei der Lokalisierung der Eierstöcke bei der Montage der Bühne zu helfen, besonders bei der Montage jüngere (zweite oder Anfang des dritten Stadiums) Eierstöcke.
- Um viele Proben gleichzeitig verarbeiten, nutzen Zelle Siebe oder andere Apparate.
- Sicherstellen, dass die Proben nie trocken.
- Wir verwenden eine gute Stereo-Mikroskop für die Montage der Bühne. Mit einer Durchlichtbasis mit einseitiger dunkler eingereicht können wir Bedingungen finden, wo der Kontrast zwischen dem transluzenten Eierstock und den weißen fetten Körper macht es leicht zu finden und zu manipulieren den Eierstöcken.
- Nach der Montage zu vermeiden wiederholte Temperaturschwankungen, verursacht diese Dissoziation des Antikörper und reduziert die Qualität der Färbung.
Dieses Protokoll kann zu früheren Larvenstadien angewendet werden, aber die fetten Körper ist anfälliger und klebriger, wodurch es etwas komplizierter. Am besten ist es Dissektionen der späten dritten Larvenstadium ersten Training.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
IM wird durch die Marie Curie Reintegration zu gewähren unterstützt. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Fund Stipendium nicht unterstützt. 1146-1108, von der Helen und Martin Kimmel Institut für Stammzellforschung am Weizmann Institute of Science und der Leir Charitable Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sucrose | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nickel plated pin holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | Corning | 7220-85 | |
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica Microsystems | ||
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| Slides | Menzel-Glaser | 798 | |
| Cover slips | Corning | 2940-223 | |
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | |
| Cell strainer | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | ||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
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