Summary
Hur nischer och stamceller bildas under utveckling är en viktig fråga med praktiska konsekvenser. I
Abstract
Många organ är beroende av stamceller för sin utveckling under fosterutvecklingen och för underhåll och reparation under vuxenlivet. Att förstå hur stamceller form, och hur de interagerar med sin omgivning är därför avgörande för att förstå utveckling, homeostas och sjukdom. Äggstocken av bananfluga Drosophila melanogaster har varit en inflytelserik modell för samspelet mellan stamceller könsceller celler (GSCs) med sina somatiska stödjeceller (nisch) 1, 2. Den kända platsen för nisch och GSCs, kopplat till förmågan att genetiskt manipulera dem, har gjort det möjligt för forskare att belysa olika interaktioner mellan stamceller och deras nischer 3-12.
Trots den uppsjö av information om mekanismer som styr GSC underhåll och differentiering, relativt lite är känt om hur GSCs och deras somatiska nischer bildas under utveckling. Om 18 somatiska nischer, vars cellulära komponenter innefattar terminalen glödlampor och celler lock (figur 1), bildar under tredje larver INSTAR 13-17. GSCs kommer från ursprungliga könsceller (PGCs). PGCs föröka sig i tidiga larvstadier, men efter bildandet av den nisch en undergrupp av PGCs blir GSCs 7, 16, 18, 19. Tillsammans somatiska nisch celler och GSCs gör en funktionell enhet som producerar ägg hela livstid organismen.
Många frågor kring bildandet av generalsekretariatets enhet förblir obesvarade. Processer såsom samordning mellan föregångare celler för nischer och stamceller prekursorer cell, eller generering av asymmetri inom PGCs när de blir GSCs, bäst kan studeras i larven. Men det är en metodisk studie av larver äggstockarna utveckling fysiskt utmanande. Först larver äggstockar är små. Även vid sena larvstadier de bara är 100μm i diameter. Dessutom äggstockarna är öppna och är inbäddade i ett vitt fett kropp. Här beskriver vi en steg-för-steg-protokollet för att isolera äggstockar från slutet third INSTAR (LL3) Drosophila larver, följt av färgning med fluorescerande antikroppar. Vi erbjuder några tekniska lösningar på problem som t.ex. lokalisering av äggstockarna, färgning och tvättning vävnader som inte sjunker, och se till att antikroppar tränga in i vävnaden. Detta protokoll kan tillämpas på tidigare larvstadier och larver testiklar också.
Protocol
1. Äggläggningen
- Fem dagar före dissekering: tillåt parade honor att lägga ägg i 2-4 timmar på färska livsmedel kompletteras med jäst. För att få synkroniserade och väl utvecklade larver, är det viktigt att inte ha överfulla odlade (ca 30 ägg / 25mm injektionsflaska). Normalt är 7-16 honor används per flaska, beroende på hur väl de låg.
2. Val av larver
- Förbered en 9-väl glas dissekera tallrik fylld med Ringers medium (128mm NaCl, 2mm KCl, 1.8mm CaCl 2, 4mm MgCl 2, 35.5mM Sackaros, 5mm Hepes pH 6,9).
- Förbered cell silar i en sex-brunnar innehåller Ringer på medellång och placera den på is. Alternativt använder vi specialtillverkade formar försedd med en nylon mesh.
- Välj tidsinställda larver från flaskan väggar med fina biologiska pincett (tång) och placera dem i Ringer innehåller dissekera maträtt.
- Överför en kvinnlig larv till en ren väl. Vi skiljer kvinnor från män av sina gonader. Man testiklarna är lätt identifieras som stora tydliga ovaler inbäddad i bakre tredjedel av fettet kroppen. Kvinna äggstockarna, som ligger vid samma del av kroppsfett, kan identifieras som en mycket mindre, klara, runda kulor.
3. Dissekering av larv
- Håll larven ner strax posteriort om hjärnan med pincett och ta bort huvudet med en andra pincett.
- Placera den återstående bakre delen på ryggsidan, med luftstrupen nedåt.
- Håll larven genom den bakre spiracles med en pincett och tryck den inåt långsamt, medan det andra paret är att skjuta nagelbanden posteriort tills ungefär hälften av larver feta kroppen framträder.
- Håller kvar bakre änden och använda den andra pincett för att löst hålla nagelbanden. Försiktigt och långsamt dra bort den bakre änden så att nagelbanden och de bifogade tarmen glida genom springan. I slutet av denna process bör det fett kroppen vara helt åtskilda från tarmen och nagelband. Koppla bort tarmen från den främre delen av fettet kroppen. För att göra färgning och montering enklare är det viktigt att fettet kroppen förblir intakt.
- Blöt en hage pipett noggrant med Ringer-medium, helst från en dissekeras väl som innehåller larver. Detta hjälper pälsen pipetten och förhindrar det fett kroppen fastnar det. Använd hagen pipetten för att överföra det fett kroppen i det iskalla Ringers medium i cellen silen.
4. Fixering och färgning
Alla steg utförs i rumstemperatur, med undantag för odling med första antikropp, vid 4 ° C.
- Inkubera det fett kroppen i 5% formaldehyd i Ringer-medium. i 20 minuter under försiktig omrörning.
- Tvätta i 5 minuter med 1% PBT (1% Triton X-100 i PBS). Upprepa detta steg i 10 minuter och en tredje gång i 45 minuter. 1% Triton X-100 krävs för att perforera larver äggstocken och låt antikroppar att penetrera den.
- Block med 0,3% PBTB (0,3% Triton X-100 och 1% BSA i PBS) i 1 timme under försiktig omrörning
- Inkubera med önskat 1: a antikroppen späds i 0,3% PBTB över natten vid 4 ° C under försiktig omrörning. Detta steg utförs vanligtvis i 0,2 ml rör på en rulle.
- Överför fett kroppen tillbaka till cellen silar.
- Tvätta 3 gånger 30 minuter vardera, med 0,3% PBTB försiktig omrörning.
- Block med 0,3% PBTB kompletteras med 5% normala åsnan serum för 1 timme under försiktig omrörning.
- Inkubera med en lämplig sekundär antikropp utspädning (enligt tillverkarens specifikation) i blockerande lösningen (0,3% PBTB kompletteras med 5% normala åsna serum hos 0,3% PBT) i 2 timmar under försiktig omrörning. Om antikroppen är fluorescerande, inkubera i mörker från denna punkt och framåt. Detta steg utförs vanligtvis i 0,2 ml rör på en rulle.
- Tvätta 3 gånger i 30 minuter vardera med 0,3% PBT försiktig omrörning.
5. Montering
- Överför kroppsfett till ett rent Eppendorf-rör. Mycket noggrant ta bort alla vätskor borta och täck omedelbart med Vectashield montering medier. Vi använder vectashield rutinmässigt eftersom det inte härdar medan äggstockarna att skiljas från den feta kroppen.
Prover kan förvaras i montering medier vid 4 ° C i upp till en vecka. - Skär i slutet av en pipettspets och använda den för att noggrant överföra det fett kroppen med minimal volym montering medier (ca 30 l för en 30mm cover-slip) på ett objektglas.
- Använd två förnicklad stift innehavare, håller 0,1 stift mm i diameter för att sprida ut fettet kroppen. Äggstockarna sitter på bakre tredjedel av fettet kroppen. Fettet kropp som omger dem vanligtvis är formad som en "blomma". Detta hjälper identifiera var äggstockarna. Dissekera ut "blommor" från resten av fettet kroppen och kasta den senare.
- Ta bort kroppsfett surroINANSIERING de gonad genom att korsa de två pinnarna försiktigt runt den. Placera isolerade gonad på bilden från fett kroppen rester.
- Täck med ett täckglas och tätning med nagellack.
- Visualisera direkt med en konfokalmikroskop. Prover kan förvaras vid 4 ° C i upp till tre veckor.
6. Representativa resultat
Vi har använt ovannämnda protokoll att följa inrättandet av flera cell linjer inom somatisk äggstocken, inklusive GSCs och deras somatiska nischer. För detta ändamål använder vi specifika antikroppar och markörer för att skilja mellan de olika celltyper i utvecklingsländerna gonad. Här visar vi ett exempel på två LL3 äggstockarna färgas med olika kombinationer av antikroppar. Figur 1A höjdpunkter terminalen glödlampor och celler lock (grön), som tillsammans utgör de somatiska cellerna i nisch. Figur 1B visar blandade celler (ICs, magenta), som direkt kontakta könsceller (blå).
Figur 1. LL3 äggstockarna. (A) monoklonal antikropp 1B1 (magenta) beskriver somatiska celler och fläckar på fusome, en intracellulär organell inom PGCs (pilar). Den förstärkare fälla HH-lacZ (anti β-galaktosidas, grön) uttrycks i terminalen filament. På basen av glödtråden somatiska locket celler (pilspetsar) kan observeras. (B) 1B1 antikropp (grön) visar på alla somatiska celler i äggstockarna. Anti-Vasa (blå) etiketter alla PGCs. PGCs direkt kontakta samsas cellerna (VA, anti-trafikstockning, magenta). Bar (för A och B) är 20 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna video visar en isolering och färgningsprotokollet sen third INSTAR larver äggstockarna. För att utföra detta protokoll rutinmässigt och tillförlitligt sätt, skall uppmärksamhet fästas vid följande punkter:
- För synkroniserade och väl utvecklade larver måste över trängsel undvikas.
- För att undvika förlust av små genomskinliga äggstockarna, se till att dissekera den feta kroppen intakt. Detta kommer också att hjälpa till med att hitta äggstockarna vid montering stadium, särskilt vid montering yngre (andra eller början av tredje INSTAR) äggstockarna.
- För att kunna hantera många prover på en gång, använda cell silar eller andra contraptions.
- Se till att proverna aldrig torr.
- Vi använder ett bra stereomikroskop för montering scenen. Med hjälp av en ljus bas med ensidigt mörk arkiveras vi kan hitta förhållanden där kontrasten mellan det genomskinliga äggstocken och vitt fett kroppen gör det enkelt att hitta och manipulera äggstockarna.
- Efter montering, undvika upprepade temperaturförändringar, detta orsakar dissociation av antikroppar och minskar kvaliteten på färgning.
Detta protokoll kan tillämpas på tidigare larvstadier men det fett kroppen är mer bräcklig och segare, vilket gör det lite mer komplicerat. Det är bäst att träna dissektioner av sena third INSTAR först.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
IM stöds av Marie Curie återintegrering bidrag. Detta arbete stöddes av Israel Science fond Grant nej. 1146-1108, av Helen och Martin Kimmel Institutet för stamcellsforskning vid Weizmann Institute of Science och leir Charitable Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sucrose | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nickel plated pin holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | Corning | 7220-85 | |
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica Microsystems | ||
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| Slides | Menzel-Glaser | 798 | |
| Cover slips | Corning | 2940-223 | |
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | |
| Cell strainer | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | ||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
