Summary
開発時にどのようにニッチと幹細胞の形態は、実用的な意味を持つ重要な問題です。の
Abstract
多くの臓器は、胚発生時と成人期の間にメンテナンスや修理のための彼らの開発のための幹細胞に依存する。どのように幹細胞形態、およびそれらがどのようにその環境と相互作用を理解することは、開発、ホメオスタシスと疾患を理解するため、非常に重要です。 ショウジョウバエの卵巣は、彼らの体細胞の支持細胞（ニッチ）1、2の生殖系列幹細胞（GSCs）の相互作用のための有力なモデルを務めている。遺伝的にそれらを操作する能力に結合ニッチの既知の場所とGSCsは、研究者は幹細胞とそのニッチ3月12日の間の相互作用の様々な解明することができました。
GSCメンテナンスと分化の制御機構に関する豊富な情報にもかかわらず、比較的少ないがGSCsとその体細胞のニッチは、開発中に形成する方法については知られている。その細胞成分の端末フィラメントとキャップの細胞（図1）、第三幼虫齢13から17の間にフォームを含む約18体細胞ニッチ、。 GSCsは、始原生殖細胞（始原生殖細胞）に由来する。 PGCは初期の幼虫の段階で増殖するが、ニッチの形成に続いて始原生殖細胞のサブグループはGSCs 7、16、18、19になります。一緒に、体細胞のニッチ細胞とGSCsは、生物の生涯を通じて卵を生成する機能的なユニットを作る。
GSCユニットの形成に関する多くの質問が未回答のままである。このようなニッチと幹細胞の前駆体の前駆細胞間の調整、またはそれらがGSCsになると始原生殖細胞内の非対称性の生成などのプロセスは、最善の幼虫で検討することができます。しかし、幼虫の卵巣の開発の方法論の研究は、物理的に困難です。最初に、幼虫の卵巣は小さくなります。であっても後期幼生の段階で彼らは、全体で唯一の100μmのです。さらに、卵巣は透明で、白い脂肪体に埋め込まれています。ここでは、蛍光抗体で染色することによってこの後に続く三齢（LL3） ショウジョウバエの幼虫、から卵巣を分離するためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。我々はそのような、卵巣の位置をシンクしていない組織を染色し、洗浄し、抗体が組織に浸透することを確認してなどの問題に対していくつかの技術的ソリューションを提供しています。このプロトコルは、以前の幼虫の段階にとだけでなく、幼虫の精巣に適用することができます。
Protocol
1。産卵
- 解剖前の5日間：交尾雌は酵母を添加した新鮮な食品に2〜4時間の卵を産むことができる。同期化されるにとよく発達した幼虫、それは（約30卵/ 25ミリメートルバイアル）培養を混雑していることが重要です。通常は、7月16日女性は彼らが横たわってどれだけに応じて、バイアルごとに使用されています。
2。幼虫の選択
- リンゲル培地（128mMのNaCl、2mMのKCL、1.8mmのCaCl 2で 、4mmのMgCl 2を 、35.5mMスクロース、5mMのHepes緩衝液pH 6.9）で満たされた9もガラス解剖皿を準備します。
- リンガーの培地を含む6ウェルプレートに細胞ストレーナーを準備し、氷の上に置きます。また、我々はナイロンメッシュを装着した特別に作られた金型を使用してください。
- 微細な生物学的なピンセット（鉗子）を使用してバイアル壁から時限幼虫を選択し、リンゲルを含む解剖皿に置いてください。
- きれいよくする女性の幼虫を移す。我々は、彼らの生殖腺で、男性から女性を区別する。雄の精巣は、簡単に脂肪体の後部3分の1に埋め込まれた大きな明確な楕円形のように識別されます。脂肪体の同じ部分に位置する女性の卵巣は、、はるかに小さい、透明な、丸い球体として識別することができます。
3。幼虫の解剖
- 鉗子で脳へのちょうど後方幼虫を押しながら、鉗子の2番目のペアと頭を取り除く。
- 気管が下向きで、背側の残りの後部を置きます。
- 鉗子の一組と後部気門で幼虫を持ち、約半分幼虫脂肪体が現れるまで、他のペアが後方キューティクルをスライドさせている間に徐々に内側に押し込みます。
- しっかりと後端を保持し、緩くキューティクルを保持するために鉗子の他のペアを使用してください。静かにゆっくりと後端のようキューティクルとギャップを介して接続されている腸のスライドを引き出します。このプロセスの最後に、脂肪体は完全に腸とキューティクルから分離する必要があります。脂肪体の前部から腸を外します。染色しやすく取り付けを行うには、それは脂肪体がそのまま残ることが重要です。
- 望ましいも含む解剖幼虫から、リンゲル培地で十分に牧草地のピペットを濡らす。これはコートピペットを助け、それにこだわってから脂肪体を防ぎます。セルストレーナーで氷冷リンゲル媒体に脂肪体を転送するために牧草地のピペットを使用してください。
4。固定と染色
すべてのステップは4℃、一次抗体とのインキュベーションを除いて、室温で行われる℃に
- リンゲル培地で5％ホルムアルデヒドで脂肪体をインキュベートする。穏やかに振盪しながら20分間。
- 1パーセントPBT（1％トリトンX - 100 PBS中）で5分間洗浄する。 10分や45分3回目ごとにこの手順を繰り返します。 1％トリトンX - 100は、幼虫の卵巣を穿孔し、抗体がそれに浸透できるようにするために必要です。
- 穏やかに攪拌しながら1時間0.3％PBTB（0.3％トリトンX - 100およびPBS中の1％BSA）でブロック
- 4℃で一晩0.3％PBTBで希釈して所望の1 回目の抗体°穏やかに振とうさせながらCでインキュベートする。このステップは通常、ローラーに0.2 mlチューブに実行されます。
- セルストレーナーに戻って体脂肪を転送します。
- 穏やかに撹拌しながら0.3％PBTBで3回、30分ごとを、洗う。
- 穏やかに攪拌しながら1時間5％正常ロバ血清を添加した0.3％PBTBでブロックする。
- 穏やかに撹拌しながら2時間ブロッキング溶液（0.3％PBTで5％正常ロバ血清を補充した0.3％PBTB）に（製造業者の仕様に従って）希釈した適切な二次抗体でインキュベートする。抗体が蛍光である場合、これ以降から暗所でインキュベートする。このステップは通常、ローラーに0.2 mlチューブに実行されます。
- PBTは、穏やかに撹拌しながら0.3％、30分ごとに3回洗浄する。
5。取り付け
- 清潔なエッペンドルフチューブに脂肪体を転送する。非常に慎重に離れてすべての液体を除去し、直ちにVectashieldマウンティングメディアでカバー。卵巣は脂肪体から分離されている間、それが硬化しないので、我々は日常的にvectashieldを使用してください。
までの週のためのサンプルは4℃で固定メディアに格納することができます。 - ピペットチップの先端をカットし、慎重に顕微鏡スライド上にマウントするメディアの最小量（30ミリメートルのカバースリップのための約30μL）で脂肪体を転送するために使用します。
- 脂肪体を分散さ0.1mmの直径のピンを保持する、二つのニッケルメッキピンホルダーを使用してください。卵巣は、脂肪体の後部3分の1程度で位置しています。それらを囲む脂肪体は通常、"花"のような形をしている。これは、卵巣の位置を特定するのに役立ちます。脂肪体の残りの部分から"花"をばらばらにすると、後者を捨てる。
- 脂肪体のsurroを削除します。その周りに慎重に2つのピンを交配することにより生殖腺をunding。離れて脂肪体の残渣からのスライド上で分離された生殖腺を置きます。
- マニキュアでカバーガラスおよびシールでカバー。
- 共焦点顕微鏡を用いて直接視覚化する。サンプルは、最大3週間まで4℃で保存することができる。
6。代表的な結果
我々はGSCsとその体細胞のニッチを含む、体の卵巣内にいくつかの細胞系譜の確立に従うように、上記のプロトコルを使用している。この目的のために我々は発展途上生殖腺における異なる細胞型を区別する特異的な抗体とマーカーを使用してください。ここでは、抗体のさまざまな組み合わせで染色されたtwo LL3卵巣の例を示します。図1Aは、端末のフィラメントと一緒にニッチの体細胞を形成するキャップ細胞（緑）、強調表示されます。図1Bは、直接生殖細胞（青）に連絡混在細胞を（ICは、マゼンタ）、を示しています。
図1。LL3卵巣。 （A）モノクローナル抗体1B1（マゼンタ）は体細胞と汚れfusomeを、始原生殖細胞内で細胞内小器官（矢印）を概説します。エンハンサートラップHH - lacZを（抗β-ガラクトシダーゼ、緑色）は、端末のフィラメントで表されます。フィラメント体キャップ細胞（矢頭）の基部に観察することができます。 （B）1B1抗体（緑）は卵巣内のすべての体細胞を概説。抗ヴァーサ（青）は、すべての始原生殖細胞にラベルを付けます。 PGCは直接混在細胞を（ICは、抗交通渋滞、マゼンタ）にお問い合わせください。バーは、（AおよびB用）20μmである。
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Discussion
このビデオでは、後期三齢幼虫卵巣の単離と染色プロトコルを示しています。日常的にかつ確実にこのプロトコルを実行するには、注意が以下の点に注意を払う必要があります。
- 同期とよく発達した幼虫の場合は、上の混雑を避ける必要があります。
- 小さな半透明の卵巣の損失を避けるために、脂肪体はそのまま分析することを確認してください。また、これは（第2または第3齢幼虫の始まり）若い卵巣を取り付ける場合は特に、取り付けの段階で卵巣を見つけるのに役立ちます。
- 一度に多くのサンプルを処理するためには、セルストレーナーや他の仕掛けを使用してください。
- 試料が乾燥しないようにします。
- 我々は、載置台に良い立体顕微鏡を使用してください。片側暗いと透過光のベースを使用すると、半透明の卵巣と白色脂肪体との間のコントラストが卵巣を見つけて、操作を容易にどこに我々は条件を見つけることができる提出した。
- 取り付けに続いて、繰り返し温度変化を避けるため、これは抗体の解離を引き起こし、染色の品質を軽減。
このプロトコルは、以前の幼虫の段階に適用さが体脂肪はそれが多少複雑になっている、より壊れやすいと粘着性であることができる。後半に最初に三齢の解剖を実践するのが最善です。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
IMは、マリーキュリーの再統合の助成金によってサポートされています。この作品は、イスラエルの科学基金グラントのないによってサポートされていました。 1146年から1108年、ヘレンと幹細胞科学のワイツマン研究所での研究とLeir慈善基金のためのマーティンキメル研究所による。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sucrose | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nickel plated pin holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | Corning | 7220-85 | |
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica Microsystems | ||
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| Slides | Menzel-Glaser | 798 | |
| Cover slips | Corning | 2940-223 | |
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | |
| Cell strainer | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | ||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
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