Summary
一个简单的实验来测量乙醇的镇静作用
Abstract
低剂量乙醇事业苍蝇成为亢进，而高剂量镇静。对一个给定的飞行应变乙醇诱导镇静的敏感性与菌株的乙醇偏好，因此，镇静是高度相关的措施，对酒精的反应和饮用水的遗传学研究。我们证明一个简单的方法，揭露苍蝇乙醇和衡量其醉人的影响。我们描述的检测可以判断急性灵敏度，以及酒精耐受重复曝光所致。它并不需要在技术上涉及的设置，并与基本的飞行文化工具，因此，可以在任何实验室应用。
Protocol
1。创建曝光室
- 用刀片切一半一小瓶插头。另外，用棉球。
- 小瓶插件的一半，或将棉花球推的食品瓶的底部，使表面光滑，苍蝇不会卡住英寸
- 如果多重曝光室，确保小瓶插头和食品，采取在每个分庭相同体积。一侧小瓶的标志，可以促进这项工作。
2。公开的苍蝇
- 收集8苍蝇的性别，年龄1-5天，定期到无酵食品小瓶曝光的前一天。
- 标签代码，例如，实验者被蒙蔽的实际基因型/应变。
- 曝光室转移到由攻八苍蝇。不要麻醉。
- 200证明乙醇添加少量的食用染料，如酸性蓝9，使它很容易看到。
- 外套一小瓶插头的底部，或棉球，用0.5毫升乙醇。
- 乙醇插头插入曝光瓶。确保酒精到小瓶中，而不是对小瓶壁面临。
- 启动一个定时器计数。
3。记录乙醇引起的中毒
- 开始后每分钟定时器，挖掘板凳上曝光室惊人死不休的苍蝇，并观察十秒钟他们。
- 记录每分钟固定苍蝇的数量。苍蝇是固定的，如果他们无法得到他们的背上，停留在一个位置，或在整个10秒的观察期的快速振动翅膀。后者苍蝇被认为是固定的，绝大多数是因为这些果蝇之间的快速翼运动时期固定。过得不固定，如果能得到他们的背上，走离和/或了小瓶墙。
- 一个暴露试验完成时记录为固定的4个或更多的苍蝇。
- 放弃苍蝇和曝光室内的空气，让以后重复使用。
4。确定的时间，以50％的镇静
镇静（ST50）50％的时间是四个八个苍蝇保持静止时，乙醇暴露开始后的时间。这是决定如下：
无论是：第一次测量分钟时，整整四个苍蝇是固定的。
或者：如果少于4苍蝇（Y1）固定在一个时间点（分钟X），和四个以上的下一个测量时间点（Y2），（X +1分钟），然后线性插值ST50使用公式：
ST50 =（4 - Y1）/（Y2 - Y1）+ X
5。重复曝光，以确定宽容
公开的苍蝇
- ST50（WT）确定为野生型控制在实验中使用的应变。
- 公开的苍蝇的实验组，乙醇如上所述。
- 测量其ST50（1），但继续揭露，直到你到达的时间2X ST50（WT）。
- 苍蝇转移到一个空的食品小瓶，并举行4小时。
- 重新暴露的苍蝇，并确定曝光2 ST50（2）。
确定公差
计算公差（％）（ST50（2）/ ST50（1） - 1）X100。
6。代表性的成果：
如图所示，是我们每基因型和剂量的苍蝇与6-8小瓶获得的一些代表性的结果。如果您的标准误差是相当大，那么系统的问题可能发生。确保乙醇面临到曝光商会，该商会是相同体积。
图1。剂量响应曲线的野生型果蝇暴露于乙醇增加的百分比。八瓶的苍蝇暴露每剂和性别。雄性和雌性果蝇显示各剂量（P> 0.22，双向ANOVA）相同的ST50，而不同剂量ST50的增加乙醇剂量（P <0.001）显着降低。请注意，从过度拥挤的瓶子苍蝇，可以大大比那些从健康瓶，而这种规模的差异可以影响ST50。铺设种子每15-20女性瓶每瓶以获得最佳的幼虫密度为1-2天。
图2。苍蝇暴露无论是90％，或100％的乙醇再现先前所描述的乙醇阻力白色rabbit1 mutation2（P <0.001，2路ANOVA）引起的。
图3。重复暴露于100％的乙醇，间隔4小时的恢复时间间隔，在ST50的显着增加的原因后，第二次曝光（P <0.001，配对t测试）。请注意，果蝇暴露在24分钟的第一次接触（对应的两倍NA已经ST50）。一个较短的时间（12分钟）曝光并没有引起ST50时再曝光（数据未显示），显着增加。
Discussion
在此演示中，我们提出一个简单的方法来确定乙醇引起的中毒，根据Bainton等以前的实验。 2000年第1和Rothenfluh等。 2006年2。由于酒精引起的镇静与相关饮酒的偏好3，这个实验是有关酒精使用障碍的研究。惊吓引起的负面geotaxis描述该实验的基础上，和酒精暴露如何干扰这种先天的反应。开始暴露之前，确保您的苍蝇表明这样一个惊人死不休的一个正常反应，即的窃听食品瓶苍蝇后，他们都应该从底部10秒的观测时间内。苍蝇减少负面geotaxis的例子包括：邦的敏感扣押突变体5，6多巴胺神经元退化所造成的运动缺陷的苍蝇。
即使描述的实验是比较简单，两个变量最值得重视，以确保可重复的结果。首先，所有暴露瓶应该是相同的音量。这包括确保小瓶的底部，包含了食物+小瓶插头/棉球的相同体积，以及含有乙醇的插头插入相同的距离为每小瓶。一个完全空的小瓶，可以用于这个实验，但它会导致较长ST50值，降低检测吞吐量。
这种试剂盒也适用于确定容忍苍蝇的数量后重复乙醇暴露发展。做重复暴露时，应考虑一些变量。首先，暴露间的时间间隔是这里描述为4小时。这个变量可以改变，但我们建议不能低于2个小时，从第一次接触，以确保清理乙醇。见尔茨等。 2000年乙醇耐受性的发展和衰变的动力学4。第二个变量要考虑的是第一次接触的时间。这显然是相同的控制和实验苍蝇。但是，这会不会导致相同数量的乙醇交付给这两个飞株。镇静剂比2活跃的苍蝇苍蝇吸收更多的乙醇，因此应变sedates早期可能会收到一个较高剂量比以后镇静应变，从而开发出更多的宽容，由于较高的初始剂量。我们郑重提醒读者进行比较时，显示在初始ST50（1）不同的菌株，宽容的发展。
我们在这里描述的检测是一个有用的工具，方便和可重复苍蝇的行为反应，以确定酒精。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢Aylin罗丹的手稿，批判性阅读和有益的讨论实验室成员。这项研究是由美国国立卫生研究院，R01AA019526支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exposure vials | www.flystuff.com | 32-116 | |
| Plugs | www.flystuff.com | 49-102 | |
| Acid Blue 9 | Sigma-Aldrich | 861146 |
References
- Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
- Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).
