Summary
Een eenvoudige test om de sederende effecten van ethanol te meten op
Abstract
Lage doseringen ethanol veroorzaken vliegt te worden hyperactief, terwijl hoge doses sederende. De gevoeligheid voor ethanol-geïnduceerde sedatie van een bepaalde vlieg stam is gecorreleerd met ethanol die stam en voorkeur, en daarom sedatie is een zeer relevant maatregel om de genetica van alcohol reacties en drinken te bestuderen. Demonstreren we een eenvoudige manier om vliegen bloot te stellen aan ethanol en meet de bedwelmende effecten. De test beschrijven we kunnen bepalen acute gevoeligheid, evenals ethanol tolerantie geïnduceerd door herhaalde blootstelling. Het vereist geen een technisch betrokken setup, en kan daardoor worden toegepast in een laboratorium met basic fly cultuur tools.
Protocol
1. Het creëren van de blootstelling kamer
- Snijd een flesje plug in half met behulp van een scheermesje. U kunt ook katoenen ballen.
- Duw de stekker half flesje, of de katoenen bal, naar de bodem van een levensmiddel flesje om een glad oppervlak dat vliegen niet vast komen te zitten binnen te maken
- Als het maken van meervoudige belichting kamers, zorg ervoor dat de flacon plug en voedsel nemen hetzelfde volume in elke kamer. Een markering op de zijkant van de flacon kan vergemakkelijken.
2. Het ontmaskeren van de vliegen
- Verzamel 8 vliegen van het ene geslacht, leeftijd 1-5 dagen, de dag voor de blootstelling in de reguliere voeding flacons zonder gist.
- Label ze in code, zodanig dat de experimentator is blind voor de werkelijke genotype / stam.
- Breng de acht vliegt in de belichting kamers door te tikken. Niet verdoven.
- Voeg een kleine hoeveelheid voedsel kleurstof, bijvoorbeeld zuur blauw 9, tot 200 bewijs ethanol te maken goed zichtbaar.
- Smeer de bodem van een flesje of de stekker of watje, met 0,5 ml ethanol.
- Steek de stekker in ethanol de belichting flacon. Zorg ervoor dat de alcohol wordt geconfronteerd in de flacon, en niet naar de wand van de flacon.
- Start een timer te tellen.
3. Record ethanol geïnduceerde intoxicatie
- Elke minuut nadat de timer is gestart, tikt u de belichting kamer op de bank om de vliegen schrikken en hen te observeren gedurende tien seconden.
- Noteer het nummer van stationaire vliegt voor elke minuut. Vliegen zijn stationaire als ze niet kunnen krijgen van hun rug, blijven op een locatie, of snel hun vleugels trillen in de gehele tien seconden observatie-periode. Deze laatste vliegen worden beschouwd als stationair, omdat de overgrote meerderheid van deze vliegen zijn stationair tussen de perioden van snelle vleugel beweging. Vliegen zijn niet stationair als ze kunnen krijgen van hun rug en lopen en / of de flacon muur.
- Een blootstelling proces is voltooid wanneer vier of meer vliegen worden opgenomen als stationair.
- Gooi vliegt en laat de blootstelling kamer lucht uit voor later hergebruik.
4. Bepaal de tijd om 50% sedatie
De tijd om 50% sedatie (ST50) is de tijd na de start van de ethanol blootstelling toen vier van de acht vliegen stil blijven staan. Dit wordt als volgt bepaald:
Ofwel: de eerste meting minuten wanneer precies vier vliegen stilstaan.
Of: indien minder dan vier vliegen (Y1) zijn stationair op een tijdstip (minuut X), en meer dan vier (Y2) bij de volgende meting tijdstip (minuut X +1), dan lineair interpoleren de ST50 volgens de formule:
ST50 = (4 - Y1) / (Y2 - Y1) + X
5. Herhaaldelijke blootstelling aan tolerantie te bepalen
Het ontmaskeren van de vliegen
- Bepaal de ST50 (wt) voor de wild-type controle stam gebruikt in uw experiment.
- Expose de experimentele groepen vliegt op ethanol zoals hierboven beschreven.
- Meten hun ST50 (1), maar verder bloot te leggen totdat u bij de tijd 2x ST50 (WT).
- Terug overdracht de vliegen in een lege flacon voedsel, en houd deze gedurende 4 uur.
- Opnieuw bloot te leggen de vliegen, en bepaal de ST50 (2) van de blootstelling 2.
Bepaal tolerantie
Bereken tolerantie in% als (ST50 (2) / ST50 (1) - 1) x100.
6. Representatieve resultaten:
Hier ziet, zijn enkele representatieve resultaten die we behaald met 6-8 flacons van vliegen per genotype en de dosis. Als uw standaardfout is aanzienlijk groter, dan is een systematisch probleem is waarschijnlijk opgetreden. Zorg ervoor dat de ethanol gezichten in de belichting kamers, en dat de kamers zijn hetzelfde volume.
Figuur 1. Dosis-respons curve van wild type vliegt blootgesteld aan toenemende percentages van ethanol. Acht flesjes van vliegen werden blootgesteld per dosis en geslacht. Mannelijke en vrouwelijke vliegt tonen dezelfde ST50 bij elke dosis (p> 0.22, 2-weg ANOVA), terwijl de ST50 over doses vermindert aanzienlijk met toenemende ethanol dosis (p <0,001). Merk op dat vliegt van overvolle flessen kunnen aanzienlijk kleiner zijn dan die van gezonde flessen, en dit verschil in grootte kan de ST50 beïnvloeden. Seed elke fles met 15-20 vrouwtjes leggen voor 1-2 dagen om een optimale larvale dichtheid per fles te krijgen.
Figuur 2. Blootstellen vliegt om ofwel 90%, of 100% ethanol reproduceert de eerder beschreven ethanol-weerstand wordt veroorzaakt door de witte rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-weg ANOVA).
Figuur 3. Herhaal de blootstelling aan 100% ethanol, verdeeld door een 4 uur durende herstel interval, veroorzaakt een aanzienlijke toename van ST50 na de tweede opname (p <0,001, gepaarde t-Test). Merk op dat de vliegen werden blootgesteld voor 24 minuten tijdens de eerste blootstelling (komt overeen met twee keer hun na ve ST50). Blootstelling gedurende een kortere tijd (12 minuten) niet leiden tot een significante toename van ST50 na hernieuwde blootstelling (gegevens niet getoond).
Discussion
In deze presentatie hebben we aangegeven een eenvoudige manier om ethanol-geïnduceerde intoxicatie te bepalen op basis van eerdere testen beschreven door Bainton et al.. 2000 1, en Rothenfluh et al.. 2006 2. Omdat alcohol-geïnduceerde sedatie is gecorreleerd met het drinken van alcohol voorkeur 3, deze test is relevant voor de studie van stoornissen door alcoholgebruik. De beschreven test is gebaseerd op de schrik-geïnduceerde negatieve geotaxis, en hoe een blootstelling aan alcohol interfereert met deze aangeboren reactie. Voordat u de risico's, zorg ervoor dat al je vliegt vertonen een normale reactie op zo'n een schrikreactie, dus na tikken beneden de vliegen in het voedsel flacon, ze allemaal moeten doorstromen van de bodem binnen een 10 seconden observatietijd. Voorbeelden van vliegen met de vermindering van negatieve geotaxis zijn bang-gevoelige beslag mutanten 5, en de motoriek-deficiënte vliegt veroorzaakt door degeneratie van dopamine neuronen 6.
Hoewel de beschreven test is relatief eenvoudig, twee variabelen verdienen de meeste aandacht aan reproduceerbare resultaten te verzekeren. Ten eerste moeten alle risico flacons hetzelfde volume. Dit omvat ervoor te zorgen dat de onderkant van de flacon hetzelfde volume van voedsel + flacon plug / watje, evenals het plaatsen van de ethanol-bevattende stekker op dezelfde afstand voor elke flacon bevat. Een volledig lege flacon kan gebruikt worden voor deze test, maar het leidt tot langere ST50 waarden, het verminderen van de doorvoer van de test.
Deze test is ook geschikt om de hoeveelheid tolerantie vliegen vast te stellen na herhaalde blootstelling aan ethanol te ontwikkelen. Een aantal variabelen moet worden overwogen bij het doen van herhaalde blootstelling. Eerst wordt de inter-exposure interval hier beschreven als 4 uur. Deze variabele kan worden gewijzigd, maar we raden het niet lager zijn dan twee uur, tot klaring van ethanol te garanderen vanaf de eerste blootstelling. Zie Scholz et al.. 2000 4 voor de kinetiek van ethanol ontwikkeling van tolerantie en verval. De tweede variabele te onderzoeken, is de duur van de eerste blootstelling. Dit heeft uiteraard dezelfde te zijn voor de controle en de experimentele vliegen. Dit kan echter niet leiden tot het dezelfde hoeveelheid ethanol geleverd aan deze beide vliegen stammen. Gesedeerd vliegt absorberen meer ethanol dan actieve vliegt twee, dus een stam die kalmeert kunnen de eerder ontvangen een hogere dosis dan een later-sederende stam, en dus de ontwikkeling van meer tolerantie ten gevolge van een hogere initiële dosis. We sterk voorzichtig de lezer bij het vergelijken van tolerantie ontwikkeling van stammen die verschillen in de initiële ST50 (1) te tonen.
De test hebben we hier beschrijven is een nuttig instrument in gemakkelijk en reproduceerbaar bepalen vliegt gedragsmatige reacties op alcohol.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Aylin Rodan voor de kritische lezing van het manuscript, en leden van het lab voor nuttige discussie. Dit onderzoek wordt ondersteund door de NIH, R01AA019526.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exposure vials | www.flystuff.com | 32-116 | |
| Plugs | www.flystuff.com | 49-102 | |
| Acid Blue 9 | Sigma-Aldrich | 861146 |
References
- Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y., Singh, C. S., Moore, M. S. Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
- Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -Y. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
- Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. Neuron. 28, 261-271 (2000).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Feany, M. B., Bender, W. W. Nature. 404, 394-398 (2000).
