Summary
We demonstreren het gebruik van DNA-microarrays voor expressie profilering van het zenuwstelsel. We beschrijven RNA kwaliteitscontrole, monster etikettering, en array-hybridisatie en scannen.
Abstract
Microarray expressie profilering van het zenuwstelsel biedt een krachtige aanpak voor de identificatie van gen-activiteiten in verschillende stadia van ontwikkeling, verschillende fysiologische of pathologische toestanden, respons op de behandeling, en in het algemeen, een aandoening die wordt experimenteel getest 1. Expressie profilering van zenuwweefsel vereist isolatie van hoge kwaliteit RNA, versterking van de geïsoleerde RNA en hybridisatie aan DNA microarrays. In dit artikel beschrijven we protocollen voor reproduceerbare microarray experimenten uit hersentumor weefsel 2. We beginnen met het uitvoeren van een kwaliteitscontrole analyse van geïsoleerde RNA monsters met Agilent 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip"-technologie. Hoge kwaliteit RNA monsters zijn cruciaal voor het succes van een microarray experiment, en de 2100 Bioanalyzer biedt een snelle, kwantitatieve meting van het monster kwaliteit. RNA monsters worden vervolgens versterkt en gelabeld door het uitvoeren van reverse transcriptie te verkrijgen cDNA, gevolgd door in vitro transcriptie in de aanwezigheid van gelabelde nucleotiden aan het label cRNA te produceren. Door het gebruik van een dual-color labeling kit, zullen we onze experimentele sample label met Cy3 en een referentie-monster met Cy5. Beide monsters worden vervolgens gecombineerd en gehybridiseerd met 4x44 K Agilent arrays. Tweekleurige arrays bieden het voordeel van een directe vergelijking tussen de twee RNA-monsters, waardoor de nauwkeurigheid van de metingen, in het bijzonder voor kleine veranderingen in de expressie niveaus, omdat de twee RNA-monsters zijn concurrerend gehybridiseerd aan een enkele microarray. De arrays zullen worden gescand op de twee bijbehorende golflengtes, en de verhouding van Cy3 te Cy5 signaal voor elke functie wordt gebruikt als een directe meting van de relatieve overvloed van het overeenkomstige mRNA. Deze analyse identificeert genen die differentieel uitgedrukt in reactie op de experimentele omstandigheden wordt getest.
Protocol
1. Kwaliteitscontrole analyse van RNA monster met 2100 Bioanalyzer
Voordat u begint,
- Denaturatie van de ladder en je monsters bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Chill onmiddellijk over in ijs.
- Reinig het instrument met elektroden RNaseZAP gedurende 1 minuut, gevolgd door RNase-vrij water voor 10 sec. Laat de elektroden aan de lucht drogen.
- Bereid de gel matrix door pipetteren 550 ul van de gel matrix in een spin-filter die bij de kit. Centrifugeer bij 1500 RCF gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Aliquot het gefilterde gel in 65 ui aliquots en bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand.
- Ter voorbereiding op de chip priming station,
- Plaats een 1-ml-spuit door de clip en in de luer-lock adapter.
- Stel de bodemplaat aan C positie door het losdraaien van de schroef onder de voet, het opheffen van de plaat en natrekken van de schroef.
- Stel de spuit clip naar de bovenste positie.
- Equilibreren de kleurstof te concentreren op kamertemperatuur. Vortex voor 10 sec. Voeg 1 ui van kleurstof om een 65 ul aliquot van gefilterde gel. Vortex goed en centrifugeer bij 13.000 RCF gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Gebruik binnen een dag.
Wanneer u klaar bent om uw monsters lopen, - Plaats een chip op de priming station. In dit protocol gebruiken we RNA 6000 nano chips. Om de gel belasting,
- Pipetteer 9 ul van de gel-kleurstof mengen in de goed gemarkeerd met een witte "G" tegen een zwarte achtergrond. Zorg ervoor dat uw tip is gepositioneerd op de bodem van de put.
- Plaats de zuiger op 1 ml. Sluit de priming station. Zorg ervoor dat click-sloten.
- Druk de zuiger naar beneden langzaam maar zeker tot hij wordt vastgehouden door de clip.
- Wacht op 30 sec. Laat de clip.
- Laat de zuiger omhoog gaat vanzelf. Nadat het stopt met bewegen, wacht een paar seconden en trek de zuiger naar de 1 ml positie. Open de priming station.
- Pipetteer 9 ul van de gel-dye mix in elk van de twee putten met "G".
- Pipetteer 5 ul van de marker in elk van de 12 monster putten en in de ladder goed.
- Pipetteer 1 ul van de voorbereide ladder ladder goed.
- Pipetteer 1 pi van elk monster in het monster putten.
- Pipetteer 1 ul van de merkdraad in elke ongebruikte monster goed.
- Vortex de chip voor een min bij 2400 rpm.
- Om de chip lopen,
- Start de 2100 Expert Software.
- Plaats de chip en sluit het deksel. Als het instrument is on-line, zal een icoontje zien of het deksel open is of gesloten is en welk type chip is geplaatst. Zorg ervoor dat de juiste poort is geselecteerd.
- Voer de test binnen 5 minuten van het laden van de monsters om verdamping te voorkomen.
2. Versterking en etikettering
Ter voorbereiding op microarray analyse, worden RNA monsters versterkt en gelabeld, meestal in een reactie op basis van T7 RNA polymerase 3. Dubbelstrengs cDNA wordt gegenereerd door reverse transcriptie. cDNA wordt gebruikt in een in vitro transcriptie reactie op het genereren van wat bekend staat als cRNA. Deze reactie wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van het label ribonucleotiden, het produceren van microgram hoeveelheden gelabeld RNA voor array hybridisatie. De keuze van amplificatie / labeling methoden hangt af van de latere microarray platform worden gebruikt. In deze paragraaf beschrijven we de generatie van de fluorescent gelabelde RNA met behulp van Quick Amp Agilent labeling kit.
- Pipetteer 50 ng tot 5 ug van RNA in een 1.5 ml buis. Het volume mag niet meer dan 8,3 pl. Indien nodig, concentreer je RNA monster met vacuüm centrifugeren of neerslag met alcohol.
- Voeg 1,2 pl T7 primer.
- Breng aan een uiteindelijk volume van 11,5 ul met RNase-vrij water.
- Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten aan de RNA denatureren. Wij raden u aan een thermocycler met een warme deksel om condensatie te voorkomen in de top van de buis.
- Tijdens de 10 min incubatie, warm 5x Eerste Strand Buffer naar 80 ° C gedurende 5 minuten. Vortex en spin down. Bewaren bij RT totdat klaar voor gebruik.
- Na de 10 minuten incubatie, snel afkoelen van de gedenatureerde RNA-monsters op ijs.
- Bereid de cDNA master mix. Per reactie, voegt u het volgende:
- 4 pl 5X Eerste Strand Buffer
- 2 pi 0,1 M DTT
- 1 ui 10 mM dNTPs
- 1 pi MMLV-RT enzym
- 0,5 ul RNase Out.
- Meng componenten door het omkeren van de buis 4 keer. Niet vortex. Spin down om de inhoud te verzamelen op de bodem van de buis.
- Voeg 8,5 pi master mix per monster. Meng door pipetteren op en neer.
- Incubeer 2 uur bij 40 ° C, gevolgd door 10 min bij 65 ° C. Wij raden u aan een thermocycler met een verwarmd deksel.
- Breng de buizen om ijs gedurende 5 minuten.
- Bereid de transcriptie master mix. Per reactie, voegt u het volgende:
- 15,3 ul nuclease-vrij water
- 20 pl4X transcriptie buffer
- 6 pl 0,1 M DTT
- 8 ul NTP
- 6,4 ul 50% PEG (PEG moet worden voorverwarmd tot 40 ° C en gevortext om te zorgen voor resuspensie)
- 0,5 ul RNase Out
- 0,6 ul anorganische pyrophosphatase
- 0,8 pl T7 RNA-polymerase
- 2,4 ul Cy3-of Cy5 CTP
- Kort draaien de monsters om de inhoud te verzamelen op de bodem van de buis.
- Voeg 60 ul van Transcription Master Mix per monster.
- Incubeer bij 40 ° C gedurende 2 uur.
- Voeg 20 ul van RNase-vrij water.
- Zuiver de gelabelde cRNA van feitelijke nucleotiden te verwijderen. Wij raden u aan RNeasy mini Qiagen's columns.
- Kwantificeren van de gelabelde cRNA. Wij raden u aan een NanoDrop2000 spectrofotometer in Microarray Meet-modus. Zorg ervoor dat u RNA-40 als het monster type.
- Record gemeten concentratie is, opbrengst (berekend als de concentratie vermenigvuldigd met het volume) en de specifieke activiteit (berekend als 1000, vermenigvuldigd met het rantsoen van de kleurstof concentratie over cRNA concentratie). Voor microarray hybridisatie, is het noodzakelijk om een opbrengst van ten minste 825 ng en een specifieke activiteit van ten minste 8 pmol / ug te bereiken.
3. Microarray hybridisatie
- Zet de hybridisatie station en op 65 ° C ten minste 2 uur voor de hybridisatie begint.
- Ter voorbereiding op de hybridisatie monster, meng het volgende in een 1,5 ml tube:
- 825 ng Cy3-cRNA (dit is meestal uw "behandeld" monster)
- 825 ng Cy5-cRNA (dit is meestal de "referentie" monster)
- 11 ul 10X blokkeren agent.
- Voeg RNase-vrij water tot een eindvolume van 52,8 ul
- Voeg 2,2 ul fragmentatie buffer.
- Vortex op lage snelheid te mengen.
- Incubeer bij 60 ° C gedurende precies 30 minuten. Dit is de cRNA fragmentatie stap, die gelabelde fragmenten genereert voor array hybridisatie. Het is zeer belangrijk om te broeden, precies zoals beschreven. Wij raden het gebruik van een thermocycler met een verwarmd deksel. Het is zeer belangrijk om te broeden, precies zoals beschreven sondes van de juiste gemiddelde lengte te genereren. Overmatige of onvoldoende fragmentatie zal resulteren in vals negatieven of false positives.
- Voeg 55 ul van 2X Hybridisatie buffer om versnippering tegen te houden. Meng door pipetteren, waarbij speciale zorg niet te bellen introduceren.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij maximale snelheid om de inhoud op de bodem van de buis te verzamelen. Als er luchtbelletjes in acht worden genomen, langer centrifuge om ze te verwijderen.
- Plaats de buis op ijs, beschermd tegen het licht. Laad het monster op de array zo snel mogelijk.
- Voor het laden van de array, eerst voor te bereiden de hybridisatie kamer. Dit protocol beschrijft het gebruik van 4x44K Agilent arrays met de Roche-Nimblegen hybridisatie systeem en A4 mixer kamers.
- Eerste plaats een microarray dia in de montage / demontage gereedschap, barcode kant.
- Open een A4-mixer en bloot de lijm. Houd de array en montage / demontage gereedschap om elke beweging te voorkomen, plaatst u de A4 mixer op de dia, te beginnen bij het einde. Zorg ervoor dat het correct is uitgelijnd met de tool. Plak de mixer langs de array dia.
- Trek van het einde van de mixer om de dia / menggroep te verwijderen.
- Met behulp van de gebalk gereedschap, drukt u langs de zelfklevende dichting om zeker te zijn is het goed gelijmd theslide. Kleine luchtbelletjes gevangen tussen de lijm en de glijbaan kan worden gezien tegen een donkere achtergrond. Neem extra tijd om deze bellen te verwijderen met de balken tool. Uw array is nu klaar om te worden geladen.
- Gebruik een positieve verplaatsing pipet tot 100 ul van de hybridisatie monster te laden. Duw de punt stevig in de haven gat, dan afzien van langzaam en gelijkmatig, zodat de lucht niet is opgesloten in de array omgeving. Probeer nooit om de sample zuigen een back-up. Nadat het gehele monster is afgegeven, moet u de top op de poort die hole, zonder het loslaten van de zuiger. Wanneer de proeven van de hele reeks covers en vloeistof begint te komen van de ontluchting-poort, snel te verwijderen van de pipet. Alleen laat de zuiger als de tip uit de buurt van de dia.
- Zachtjes deppen het overtollige vocht in beide havens. Zorg ervoor dat je geen steekproef te trekken uit de kamer zelf.
- Bedek de patrijspoorten met stickers met behulp van een pincet.
- Zet de schuif op de hybridisatie station, en controleer of de blaas gaten correct zijn geplaatst over de O-ringen. Dit zal zorgen voor een goede menging tijdens de hybridisatie.
- Sluit het deksel en schuif het station deksel. Stel het station naar mixing mode B.
- Hybridiseren de array bij 65 ° C gedurende 17 uur.
- Bereid Wash Buffer 2 door de toevoeging van Triton X-102 tot een uiteindelijke concentratie van 0,005%. Bewaren bij 37 ° C gedurende de nacht.
4. Microarray wassen
- Voeg Triton X-102 tot en met Buffer 1 Wash tot een uiteindelijke concentratie van 0,005%. Bewaren bij kamertemperatuur Temperatuure.
- Wanneer hybridisatie klaar is, vul een glazen schaal "A" met Wash Buffer 1. De schotel moet groot genoeg zijn om de montage / demontage gereedschap vast te houden en een aantal manoeuvres toelaten ook. Alle wast moet worden gedaan in glaswerk. Vermijd plastic schaaltjes, aangezien ze meestal lekken verbindingen wat resulteert in hoge achtergrond in de array.
- Doe een dia rack en een roer bar in een verkleuring schotel "B". Vul met Wash buffer 1, en zorg ervoor dat dekt de rek. Leg ze op een plaat roer bij kamertemperatuur.
- Plaats een roerstaafje op een lege vlekken schaal "C" en leg ze op een bord roer.
- Verwijder de array en zet het in de montage / demontage gereedschap. Dompel het geheel in de schotel "A".
- Terwijl u de montage / demontage gereedschap en de dia uit tegenovergestelde zijden met een hand, zorgvuldig verwijderen van de A4 mixer. Zorg ervoor dat u niet de array gebied scratch.
- Plaats snel de glijbaan in het rek in de vlekken schotel "B". Van nu af aan moet de blootstelling aan de lucht worden geminimaliseerd, omdat de Cy5 kleurstof is gevoelig voor ozon. Niet wassen meer dan 8 arrays op een moment.
- Was gedurende 1 minuut roeren met gemiddelde snelheid.
- Vul vlekken schotel "C" met voorverwarmd Wash buffer 2. Overdracht van de dia's en was gedurende 1 minuut.
- Heel langzaam verwijderen van de glijbaan rack van vlekken schotel "C" om druppels achter op de slide te minimaliseren.
- Droog de slide door het draaien van 2 minuten. Als een compatibele centrifuge niet beschikbaar is, centrifuge de dia in een 50-ml conische buis of blazen argon gas over.
- Plaats de glaasjes in een 50 ml conische buis en vul het met argon gas. Scan direct naar signaalverlies te voorkomen. Wij raden het gebruik van de GenePix 4000B scanner uit Molecular Devices.
5. Representatieve resultaten:
Goede kwaliteit totaal RNA monsters moeten produceren slechts twee grote pieken wanneer deze wordt uitgevoerd in een Bioanalyzer voor kwaliteitscontrole, die overeenkomen met de twee belangrijkste ribosomaal RNA soorten. Sommige RNA degradatie zal te zien zijn als een uitstrijkje voor de eerste ribosomaal RNA piek. Ernstig is aangetast, zal een lage kwaliteit RNA tonen een brede piek of een reeks van pieken bij lage retentietijd, terwijl de twee ribosomaal RNA toppen zal zijn van zeer lage intensiteit of niet identificeerbaar is helemaal. Voor voorbeelden van de 2100 Bioanalyzer uitgang, zie figuur 1.
De Expert 2100 software berekent een RNA Integrity nummer, of RIN, als een kwantitatieve meting van RNA kwaliteit. Hoge kwaliteit monsters, met RIN waarden hoger dan 9, zijn uiteraard het beste voor microarray-toepassingen. Toch hebben we gebruik gemaakt monsters met RIN waarden zo laag als 5.2 in het genereren van microarray data van redelijke kwaliteit.
Goede kwaliteit arrays moet produceren een hoge signaal tegen relatief lage PMT waarden. In ons experiment zijn de meeste van de transcripten verwacht aanwezig te zijn op een vergelijkbaar niveau in de experimentele en de referentie-steekproef; grote, grootschalige veranderingen in genexpressie zal waarschijnlijk een gebrek een biologische betekenis. Daarom moet het grootste deel van de array gele uitstraling in plaats van groen of rood. Goede kwaliteit signalen moet ook in een dynamisch bereik, zodat het signaal histogrammen volledig overlappen. Voor voorbeelden, zie figuur 2.
Figuur 1. Voorbeeld van vier RNA monsters geïsoleerd van menselijke hersenen tumorweefsel. RNA werd geïsoleerd met behulp van het protocol gepresenteerd in 3.1.1. Monster kwaliteit werd beoordeeld aan de hand van de 2100 Bioanalyzer op een RNA-6000-chip, zoals beschreven in 3.1.3. Monsters representatief zijn voor 4 verschillende RNA kwaliteiten: A, zeer goede kwaliteit-RNA (RIN> 9), B, gedeeltelijk afgebroken RNA (RIN 5-6, let op de aanzienlijk lagere piek voor 28S rRNA), C, zeer gedegradeerd RNA (RIN < 3), D, bijna volledig afgebroken RNA (RIN = 2). We hebben met succes gebruikt monsters met kwaliteiten gelijk aan of beter is dan B (RIN> 5.2) voor de downstream microarray toepassingen. Solide en open pijlpunten geven de positie van de 18S en 28S rRNA soorten, respectievelijk.
Figuur 2. Voorbeelden van reeks beelden en puntgrafieken. A, hele dia te bekijken, waarop de vier arrays in de 4X44K Agilent formaat; B, hoge resolutie scan van een van de array gebieden, er rekening mee dat geen van de signalen (rood of groen) moet overheersen, C, spreidingsdiagram van het beeld in B, er rekening mee dat de signalen volledig overlap en niet meer dan 1x10 -6 functies zijn op verzadigen intensiteit.
Discussion
Expressie profilering met DNA microarrays biedt een eenvoudige benadering van differentieel tot expressie genen te identificeren tussen de twee biologische monsters. Succesvolle expression profiling experimenten vereisen een hoge kwaliteit-RNA monsters, robuuste etikettering en hybridisatie. In onze ervaring, de commerciële arrays en etikettering kits van Agilent bieden een hoge kwaliteit van de gegevens tegen een redelijke prijs. Terwijl Agilent biedt ook hun eigen hybridisatie en scannen machines, hebben we het voordeel van de hybridisatie systeem van Roche-Nimblegen en de GenePix 4000B microarray scanner uit Molecular Devices. Merk op dat de Roche-Nimblegen hybridisatie unit voorheen bekend stond als het MAUI hybridisatie-systeem. Na de recente bedrijfsschandalen overname door Roche, zijn de A4 mixers stopgezet. Vanaf het moment van dit schrijven, kunnen ze nog steeds te vinden via andere verkopers, zoals Kreatech Diagnostics ( www.kreatech.com , deze website biedt ook een handige waaier compatibiliteit tool), maar op lange termijn de beschikbare voorraad is onzeker. Andere hybridisatie systemen zijn beschikbaar (bijvoorbeeld van Agilent), maar als compatibele mixers kan worden gevonden voor de array wordt gebruikt, adviseren wij de Roche-Nimblegen systeem om zijn kwaliteit en reproduceerbaarheid.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan ED uit de James S. McDonnell Stichting 21 st Century Award Programma, en New Innovator een NIH Director's Award. GAB is gedeeltelijk ondersteund door een postdoctoraal fellowship van het California Institute of regeneratieve geneeskunde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
| 2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
| Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
| Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
| Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
| Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
| A4 mixer hybridization chambers | |||
| Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
| Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
| Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
| Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
| Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
| GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
References
- Diaz, E. One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease. Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).
- Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).
- Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).
