Summary
אנו מדגימים את השימוש microarrays DNA עבור פרופיל הביטוי של מערכת העצבים. אנו מתארים לשלוט RNA איכות, תיוג המדגם, הכלאה מערך סריקה.
Abstract
פרופיל microarray ביטוי של מערכת העצבים מספק גישה רב עוצמה לזיהוי פעילויות גן בשלבים שונים של פיתוח, או מצבים פיזיולוגיים פתולוגיים שונים, התגובה לטיפול, ובאופן כללי, כל מצב זה נבדק בניסוי 1. פרופיל הביטוי של רקמות עצביות דורש בידוד של איכות גבוהה RNA, הגברה של רנ"א מבודד הכלאה כדי microarrays DNA. במאמר זה נתאר פרוטוקולים לניסויים microarray לשחזור מרקמת המוח הגידול 2. נתחיל ידי ביצוע בקרת איכות ניתוח של דגימות RNA בודד עם 2100 של Agilent Bioanalyzer טכנולוגיית "מעבדה על שבב". איכות גבוהה דגימות RNA הם קריטיים להצלחת הניסוי כל microarray, ואת 2100 Bioanalyzer מספק מדידה מהירה, כמותית של איכות המדגם. דגימות RNA הם מוגבר אז שכותרתו ידי ביצוע שעתוק לאחור כדי לקבל cDNA, ואחריו ב שעתוק במבחנה בנוכחות של נוקלאוטידים שכותרתו לייצר Crna שכותרתו. באמצעות ערכת כפול צבע תיוג, אנו תווית מדגם הניסוי שלנו עם Cy3 ו מדגם התייחסות עם Cy5. דגימות הן מכן ניתן יהיה משולב הכלאה למערכי 4x44 של Agilent K. Dual-צבע מערכים להציע את היתרון של השוואה ישירה בין שתי דגימות רנ"א, ובכך להגדיל את רמת הדיוק של המדידות, בפרט עבור שינויים קטנים ברמות הביטוי, כי שתי דגימות RNA הם הכלאה תחרותי כדי microarray יחיד. מערכים ייסרקו על שני אורכי הגל המתאים, יחס אות Cy3 כדי Cy5 עבור כל תכונה תשמש מדידה ישירה של השפע היחסי של mRNA המתאים. ניתוח זה מזהה את הגנים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בתגובה תנאי הניסוי נבדק.
Protocol
1. בקרת איכות ניתוח של מדגם RNA עם 2100 Bioanalyzer
לפני שתתחיל,
- לפגל את הסולם דגימות שלך ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צ'יל מיד על הקרח.
- נקו את המכשיר עם אלקטרודות RNaseZAP דקות 1, ואחריו מים RNase חינם למשך 10 שניות. אפשר אלקטרודות אוויר יבש.
- הכינו את הג'ל על ידי מטריקס pipeting 550 μl של מטריקס הג'ל לתוך מסנן ספין המסופק עם הערכה. צנטריפוגה ב RCF 1500 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. Aliquot המסוננת הג'ל לתוך 65 aliquots μl ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1.
- כדי להכין את התחנה תחול שבב,
- הכנס מזרק 1 מ"ל באמצעות קליפ לתוך המתאם לנעול luer.
- התאם את צלחת הבסיס לעמדה C על ידי שחרור הבורג מתחת לבסיס, מרימים את הצלחת retightening את הבורג.
- התאם את הסרטון המזרק המיקום העליון.
- לאזן להתרכז לצבוע לטמפרטורת החדר. וורטקס עבור 10 שניות. הוסף 1 μl של צבע כדי aliquot 65 μl של ג'ל מסונן. וורטקס היטב צנטריפוגות ב RCF 13,000 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש בתוך יום אחד.
כאשר אתה מוכן להפעיל דגימות שלך, - מיקום השבב בתחנת תחול. בפרוטוקול זה אנחנו באמצעות RNA 6000 שבבי ננו. כדי לטעון את הג'ל,
- פיפטה 9 μl של לערבב ג'ל צבע ב המסומן היטב עם לבן "G" על רקע שחור. ודא הטיפ שלך ממוקמת בתחתית הבאר.
- מקם את הבוכנה מזרק ב 1 מ"ל. סגור את תחנת תחול. ודא זה לחץ, מנעולים.
- לחץ על הבוכנה כלפי מטה לאט אך בהתמדה, עד מוחזק על ידי קליפ.
- המתן 30 שניות. שחרר את הקליפ.
- בואו הבוכנה לעלות בכוחות עצמו. אחרי זה מפסיק לזוז, ולחכות כמה שניות למשוך את הבוכנה בחזרה למצב 1 מ"ל. פתח את תחנת תחול.
- פיפטה 9 μl של לערבב ג'ל צבע בכל אחד 2 בארות מסומן "G".
- פיפטה 5 μl של הסמן על כל אחד מ -12 בארות מדגם ב הסולם היטב.
- פיפטה 1 μl הסולם שהוכן סולם היטב.
- פיפטה 1 μl של כל דגימה לתוך בארות המדגם.
- פיפטה 1 μl של הסמן במדגם כל מנוצל היטב.
- וורטקס השבב דקות 1 ב 2400 סל"ד.
- כדי להפעיל את השבב,
- הפעל את התוכנה 2100 מומחה.
- מקם את שבב ולסגור את המכסה. אם המכשיר הוא on-line, סמל יראה אם המכסה פתוח או סגור ואיזה סוג של השבב מוכנס. ודא כי יציאת הנכונה מסומנת.
- הפעל את assay בתוך 5 דקות של טעינה דגימות על מנת למנוע אידוי.
2. הגברה וסימון
כדי להתכונן לניתוח microarray, דגימות RNA הם מוגבר ומסומן, בדרך כלל בתגובה המבוססת על RNA פולימראז T7 3. תקועים פעמיים cDNA נוצר על ידי שעתוק לאחור. cDNA משמש בתגובה שעתוק במבחנה כדי לייצר מה שמכונה קרנה. תגובה זו מתבצעת בנוכחות ribonucleotides שכותרתו, לייצר כמויות מיקרוגרם של רנ"א שכותרתו עבור הכלאה המערך. הבחירה של הגברה / תיוג שיטות תלוי פלטפורמת microarray לאחר לשמש. בסעיף זה, אנו מתארים את הדור של רנ"א שכותרתו fluorescently באמצעות תיוג הערכה מהירה של Agilent Amp.
- פיפטה 50 ננוגרם ל 5 מיקרוגרם של רנ"א בצינור 1.5 מ"ל. נפח לא יעלה על 8.3 μl. אם יש צורך, להתרכז מדגם RNA שלך על ידי צנטריפוגה ואקום או משקעים עם אלכוהול.
- הוספת 1.2 μl של פריימר T7.
- מביאים נפח סופי של μl 11.5 במים RNase חינם.
- לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפגל את הרנ"א. אנו ממליצים להשתמש thermocycler עם מכסה חם כדי למנוע התעבות בחלק העליון של הצינור.
- במהלך הדגירה 10 דקות, חם הצפת 5X סטרנד ראשון עד 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. וורטקס ו ספין למטה. שמור על RT עד מוכן לשימוש.
- לאחר דגירה 10 דקות, במהירות לצנן את דגימות מפוגל RNA על הקרח.
- מכינים את תערובת מאסטר cDNA. לפי התגובה, להוסיף את הדברים הבאים:
- 4 סטרנד μl 5X ראשון הצפת
- 2 μl 0.1 M DTT
- 1 μl 10 mM dNTPs
- 1 אנזים μl MMLV-RT
- 0.5 μl Out RNase.
- מערבבים את מרכיבי ידי צינור היפוך 4 פעמים. אל מערבולת. ספין למטה כדי לאסוף את התוכן בחלק התחתון של הצינור.
- הוספת 8.5 μl של תמהיל מאסטר לדגימה. מערבבים על ידי pipeting למעלה ולמטה.
- דגירה עבור שעה 2 ב 40 ° C, ואחריו 10 דקות בשעה 65 ° C. אנו ממליצים להשתמש thermocycler עם מכסה מחומם.
- העברת צינורות לקרח דקות 5.
- מכינים את תערובת מאסטר שעתוק. לפי התגובה, להוסיף את הדברים הבאים:
- 15.3 מים μl nuclease חינם
- 20 μlשעתוק 4X חיץ
- 6 μl 0.1 M DTT
- 8 NTPs μl
- 6.4 PEG 50% μl (PEG יש prewarmed עד 40 ° C ו vortexed כדי להבטיח resuspension)
- 0.5 RNase μl Out
- 0.6 pyrophosphatase אורגניים μl
- 0.8 μl T7-RNA פולימראז
- 2.4 μl Cy3 או Cy5 CTP
- בקצרה ספין דגימות כדי לאסוף את התוכן בתחתית הצינור.
- הוסף 60 μl של מיקס מאסטר תמלול לדגימה.
- לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
- הוסף 20 μl מים RNase חינם.
- לטהר את קרנה שכותרתו להסיר נוקלאוטידים מאוגדים. אנו ממליצים להשתמש בעמודות מיני RNeasy של Qiagen.
- לכמת את קרנה שכותרתו. אנו ממליצים להשתמש ספקטרופוטומטר NanoDrop2000 במצב מדידה microarray. הקפד לבחור RNA-40 כסוג המדגם.
- מדגם ריכוז שיא, התשואה (כפי שחושב ריכוז כפול נפח) פעילות ספציפית (כפי שחושב 1000 מוכפל לקצוב את ריכוז לצבוע מעל ריכוז קרנה). עבור הכלאה microarray, זה הכרחי כדי להשיג תשואה של לפחות 825 ננוגרם וכן פעילות ספציפית של pmol לפחות 8 / מיקרוגרם.
3. Microarray הכלאה
- הפעל את התחנה הכלאה ולהגדיר ב 65 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני הכלאה מתחיל.
- כדי להכין את המדגם הכלאה, לערבב את הדברים הבאים צינור 1.5 מ"ל:
- 825 ננוגרם Cy3-קרנה (זה בדרך כלל "טיפול" שלך לדוגמה)
- 825 ננוגרם Cy5-קרנה (זה בדרך כלל שלך מדגם "הפניה")
- 11 μl סוכן חסימת 10X.
- הוסף RNase ללא מים לנפח סופי של μl 52.8
- הוסף חוצץ הפיצול μl 2.2.
- וורטקס במהירות נמוכה לערבב.
- לדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בדיוק. זהו הצעד הפיצול קרנה, אשר מייצר שברי שכותרתו עבור הכלאה המערך. חשוב מאוד כדי לדגור בדיוק כפי שתואר. אנו ממליצים להשתמש thermocycler עם מכסה מחומם. חשוב מאוד כדי לדגור בדיוק כפי שתואר ליצור בדיקות אורך הממוצע הנכון. פרגמנטציה מוגזמת או לא מספקת תגרום שליליות או חיוביות שגויות שווא.
- הוסף 55 μl של חיץ הכלאה 2X להפסיק את הפיצול. מערבבים על ידי pipetting, מטפלת מיוחדת לא להכניס בועות.
- צנטריפוגה 1 דקות במהירות המרבית כדי לאסוף את התוכן בחלק התחתון של הצינור. אם הבועות נצפות, עוד צנטריפוגות כדי להסיר אותם.
- מניחים את הצינור על הקרח, מוגן מפני האור. טען המדגם במערך בהקדם האפשרי.
- כדי לטעון את המערך, תחילה להכין את החדר הכלאה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכים 4x44K של Agilent עם מערכת Roche-NimbleGen הכלאה ו מערבל לתאי A4.
- המקום שקופיות microarray בצד ברקוד הרכבה / כלי פירוק הראשון.
- פתח מערבל A4 ולחשוף את דבק. החזקת מערך והרכבה / פירוק כלי כדי למנוע כל תנועה, המקום מערבל A4 בשקופית, החל בקצה המרוחק. וודא שהוא מיושר כראוי הכלי. סטיק מיקסר לאורך כל שקופית המערך.
- משוך מסוף מערבל כדי להסיר את החלק / הרכבה מערבל.
- באמצעות הכלי נוער, לחץ כל הזמן אטם דבק כדי לוודא שהוא מודבק בחוזקה theslide. בועות אוויר קטנות לכודים בין דבק ועל השקופיות ניתן לראות על רקע כהה. קח את הזמן הנוסף כדי להסיר בועות אלה עם הכלי נוער. מערך שלך עכשיו הוא מוכן להיות טעון.
- השתמש פיפטה תזוזה חיובית לטעון 100 μl של המדגם הכלאה. דחפו את קצה בחוזקה בתוך חור היציאה, ואז לוותר לאט חלקה כך שהאוויר לא נלכד באזור המערך. לעולם אל תנסה למצוץ את המדגם לגבות. לאחר המדגם כולו כבר לוותר, לשמור על קצה חור היציאה מבלי לשחרר את הבוכנה. כאשר המדגם מכסה את מערך שלם הנוזל מתחיל לצאת יציאת האוורור, במהירות להסיר את פיפטה. רק לשחרר את הבוכנה פעם קצה הוא מן השקופית.
- להספיג בעדינות את הנוזל העודף בנמלים שניהם. הקפד לא למשוך מדגם מתוך החדר עצמו.
- מכסים את החורים יציאת עם מדבקות באמצעות פינצטה.
- שים את השקופית תחנת הכלאה, ולבדוק כי חורים שלפוחית השתן ממוקמים בצורה נכונה על טבעות האטם. זה יבטיח ערבוב נאות במהלך ההכלאה.
- סגור את המכסה להחליק את המכסה התחנה. הגדר את התחנה ערבוב במצב B.
- להכליא את המערך ב 65 מעלות צלזיוס למשך 17 שעות.
- הכן לשטוף הצפת 2 על ידי הוספת טריטון X-102 לריכוז סופי של 0.005%. שמור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. Microarray כביסה
- הוסף טריטון X-102 כדי לשטוף הצפת 1 עד ריכוז סופי של 0.005%. שמרו על חדר temperaturה
- כאשר הכלאה גמורה, למלא צלחת זכוכית "A" עם הצפת שטפי 1. המנה צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל את כלי הרכבה / פירוק לאפשר כמה תמרונים גם כן. שוטף כל צריך להיעשות זכוכית. הימנע צלחות פלסטיק, שכן הם נוטים תרכובות ליץ וכתוצאה מכך רקע גבוה במערך.
- שים מתלה שקופיות בר ומערבבים "B" צלחת מכתים. מלא עם חיץ שטפי 1, מוודא שהוא מכסה את מתלה. מניחים על צלחת ומערבבים בטמפרטורת החדר.
- שימי פס לבחוש בצלחת מכתים ריק "C" ומניחים על צלחת ומערבבים.
- הסר את מערך ושמתי אותו כלי הרכבה / פירוק. להטביע את הרכבה שלם בצלחת "A".
- בעוד מחזיק את כלי הרכבה / פירוק השקופית משני צדי ביד אחת, בזהירות לקלף מערבל A4. הקפד לא לשרוט את האזור המערך.
- המקום במהירות את השקופית במעמד ב מכתים צלחת "B". מעתה והלאה, חשיפה לאוויר צריך להיות ממוזער מאז לצבוע Cy5 רגיש האוזון. אין לשטוף יותר מ 8 מערכים בכל פעם.
- שטפי עבור 1 דקה תוך ערבוב במהירות בינונית.
- מלאו צלחת מכתים "C" עם חיץ מראש חימם שטוף 2. העברת שקופיות לשטוף דקה 1.
- לאט לאט להסיר את מתלה שקופיות מכתים צלחת "C" כדי למזער את הטיפות שנותרו מאחור בשקופית.
- יבש את השקופית על ידי ספינינג במשך 2 דקות. אם צנטריפוגה תואם אינו זמין, צנטריפוגה השקופית בצינור 50 מ"ל קונית או לפוצץ גז ארגון על זה.
- מגלשות מקום בצינור 50 מ"ל חרוטי ולמלא אותו עם גז ארגון. סריקה מיידית כדי למנוע אובדן האות. אנו ממליצים להשתמש בסורק GenePix 4000B מן התקנים מולקולריים.
5. נציג תוצאות:
טוב בסך הכל איכות דגימות רנ"א צריך לייצר רק שני שיאים גדולים כאשר לרוץ Bioanalyzer לבקרת איכות, המקביל ל 2 המינים העיקריים RNA ריבוזומלי. חלק השפלה RNA יראה כמו למרוח לפני השיא first-RNA ריבוזומלי. מושפל קשות, RNA באיכות נמוכה תציג שיא רחב או סדרה של פסגות בזמנים ושמירה נמוך, בעוד 2 פסגות RNA ריבוזומלי יהיה בעצימות נמוכה מאוד או לא מזהה בכלל. לדוגמאות של הפלט Bioanalyzer 2100, ראה איור 1.
התוכנה מומחה 2100 יחשב מספר Integrity RNA, או רין, כמו מדידה כמותית של איכות RNA. דגימות באיכות גבוהה, עם ערכים רין גבוה יותר מאשר 9, הם ללא ספק הטוב ביותר עבור יישומים microarray. עם זאת, השתמשנו דגימות עם ערכים רין נמוך כמו 5.2 ביצירת נתוני microarray באיכות סבירה.
מערכי איכות טובה צריך לייצר אות גבוה בערכים PMT נמוך יחסית. בניסוי שלנו, רוב תמלילי צפויים להיות נוכחים ברמה דומה במדגם הניסוי הפניה; מסיבי, שינויים נרחבים ביטוי גנים כנראה חוסר משמעות ביולוגית. לכן, ברוב של המערך צריך להיראות צהוב ולא ירוק או אדום. אותות איכות טוב צריך להיות גם בטווח דינמי כזה היסטוגרמות אות חפיפה מלאה. לדוגמאות, ראה איור 2.
באיור 1. דוגמה של ארבע דגימות RNA שבודד רקמת המוח האנושי הגידול. RNA היה מבודד באמצעות פרוטוקול שהוצג 3.1.1. איכות המדגם הוערכה באמצעות 2100 Bioanalyzer על שבב 6000 RNA כמתואר 3.1.3. דוגמאות הן נציג של 4 איכויות שונות RNA: A, איכות טובה מאוד RNA (רין> 9); B, RNA מושפל חלקית (5-6 רין, שים לב שיא נמוך משמעותית עבור rRNA -28); C, RNA מושפל מאוד (רין < 3); ד ', כמעט מושפל לחלוטין RNA (רין = 2). יש לנו בהצלחה השתמשו בדגימות עם תכונות דומות או יותר B (רין> 5.2) עבור יישומים microarray במורד הזרם. ראשי חץ מוצק לפתוח לציין את המיקום של 18S rRNA ו -28 מינים, בהתאמה.
איור 2. דוגמאות של תמונות מערך ומגרשים פיזור. תצוגה מקדימה, שקופית שלם, המראה את ארבעת מערכי בפורמט 4X44K Agilent, B, סריקה ברזולוציה גבוהה של אחד האזורים מערך, שים לב שאף אחד האותות (אדום או ירוק) הוא השולט, C, העלילה פיזור של התמונה B, לציין כי אותות חפיפה מלאה ולא יותר מ -6 1x10 תכונות בעצימות להרוות.
Discussion
פרופיל הביטוי עם microarrays DNA מספק גישה פשוטה לזיהוי גנים הביע באופן דיפרנציאלי בין שתי דגימות ביולוגיות. פרופיל מוצלח ניסויים ביטוי דורשים איכות גבוהה דגימות רנ"א, תיוג חזקים הכלאה. מניסיוננו, מערכי מסחריים ערכות תיוג של Agilent לספק נתונים באיכות גבוהה במחיר סביר. בעוד Agilent מציעה גם ההכלאה שלהם במכונות סריקה, אנחנו בעד מערכת הכלאה בין רוש-NimbleGen ואת 4000B GenePix סורק microarray מן התקנים מולקולריים. ראוי לציין, כי יחידת Roche-NimbleGen הכלאה היה ידוע בעבר בשם מערכת הכלאה מאווי. לאחר הרכישה האחרונה של החברה על ידי חברת רוש, מערבלי A4 שהופסקו. נכון לרגע כתיבת שורות אלה, הם עדיין יכולים למצוא דרך מוכרים אחרים כגון Kreatech אבחון ( www.kreatech.com ; אתר זה מציע גם כלי נוח תאימות במערך), אבל לטווח ארוך זמינות מלאי אינה ודאית. מערכות הכלאה אחרים זמינים (לדוגמה, מ - Agilent), אולם אם מערבלי תואם ניתן למצוא את מערך בשימוש, אנו ממליצים על המערכת של רוש, NimbleGen עבור איכותו reproducibility.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ED מן ס ג'יימס מקדונל קרן 21 תוכנית פרס רח' המאה, ואת פרס ממציא ניו מנהל של NIH. במודלים של GAB נתמך בחלקו על ידי מענק דוקטורט ממכון קליפורניה של רפואה רגנרטיבית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
| 2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
| Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
| Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
| Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
| Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
| A4 mixer hybridization chambers | |||
| Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
| Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
| Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
| Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
| Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
| GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
References
- Diaz, E. One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease. Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).
- Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).
- Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).
