Summary
我々は、神経系の発現プロファイリングのためのDNAマイクロアレイの使用例を示します。我々は、RNAの品質管理、サンプルのラベリング、およびアレイハイブリダイゼーションとスキャニングを説明します。
Abstract
神経系のマイクロアレイの発現プロファイリングは、開発のさまざまな段階で特定する遺伝子の活動への強力なアプローチ、さまざまな生理的または病理学的状態、治療への反応、及び、一般的に、実験的に1をテストされているいずれかの条件が用意されています。神経組織の発現プロファイリングは、単離されたRNAとDNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションの増幅、高品質のRNAの分離を必要とします。この記事では、脳腫瘍の組織2からの再現性のあるマイクロアレイ実験のためのプロトコルについて説明します。我々は、Agilentの2100バイオアナライザ"ラボオンチップ"技術で分離されたRNAサンプルの品質管理分析を行うことにより開始されます。高品質なRNAサンプルは、任意のマイクロアレイ実験の成功のために重要である、と2100バイオアナライザは、サンプルの品質の迅速、定量的な測定を提供します。 RNAサンプルは、標識cRNAを生成するために標識されたヌクレオチドの存在下でin vitro転写により続いて、cDNAを得るために逆転写を行うことにより増幅し、ラベルが付いています。デュアルカラーラベリングキットを使用することにより、我々は、Cy3およびCy5と参照試料との我々の実験サンプルにラベルを付けます。両方のサンプルを、組み合わせるとAgilentの4x44 Kアレイにハイブリダイズされる。デュアルカラーの配列は、2つのRNAサンプルは、単一のマイクロアレイに競合ハイブリダイズされているため、それによって、発現レベルの小さな変化のために特に、測定の精度を高める、2つのRNAサンプル間の直接比較の利点を提供する。配列は2つの対応する波長でスキャンされ、そして各機能のCy3のにCy5シグナルの比率は、対応するmRNAの相対量の直接測定として使用されます。この分析では、差動テストされている実験条件に対応して発現される遺伝子を識別します。
Protocol
1。 2100バイオアナライザによるRNAサンプルの品質管理分析
始める前に、
- ℃で10分間、70梯子して、サンプルを変性させる。氷の上ですぐに冷やします。
- 10秒のためにRNaseフリー水に続いて1分間RNaseZAPと楽器の電極を、清掃してください。電極は空気乾燥することができます。
- キットに付属のスピンフィルターにゲルマトリックス550μlをペッティングによってゲルマトリックスを準備します。室温で10分間1500 RCFで遠心する。分注し、最大1ヶ月までは4で65μlを、店舗° Cにゲルをろ過した。
- チッププライミングステーションを準備するには、
- クリップに通してとルアーロックアダプタに1mlの注射器を挿入します。
- プレートを持ち上げ、ネジの増し締めは、ベースの下にネジを緩めて、Cを配置するためにベースプレートを調整します。
- トップの位置にシリンジクリップを調整します。
- 室温への染料濃縮物を平衡化させます。 10秒間ボルテックスする。フィルタリングされたゲルの65μlのアリコートに染料を1μlを追加。よくボルテックスし、室温で10分間13,000 RCFで遠心。 1日以内に使用してください。
あなたのサンプルを実行する準備ができたら、 - プライミングステーション上にチップを置きます。このプロトコルでは、RNA 6000ナノチップを使用しています。ゲルをロードするには、
- よく黒の背景に白の"G"が付いているのゲル色素混合のピペット9μL。あなたの先端がウェルの最下部に配置されていることを確認します。
- 1ミリリットルで、シリンジのプランジャーを置きます。プライミングステーションを閉じます。それは、ロックをクリックすることを確認してください。
- それは、クリップで固定されるまでゆっくりと、しかし着実にプランジャーを押し下げて。
- 30秒間待ちます。クリップを離します。
- プランジャーが自動的に起動行きましょう。それは移動を停止した後、数秒待つと1 mlの位置に戻ってプランジャーを引く。プライミングステーションを開きます。
- "G"マーク2のウェルの各々のゲル色素混合のピペット9μL。
- 12サンプルウェルの各々で、よくはしごのマーカーのピペットを5μl。
- よくはしごの準備はしごのピペット1μL。
- ピペットサンプルウェルに各サンプルを1μl。
- よく、各未使用のサンプルにおけるマーカーのピペット1μL。
- 渦2400 rpmで1分間チップ。
- チップを実行するには、
- 2100エキスパートソフトウェアを起動します。
- チップを置き、蓋を閉じます。楽器がライン上にある場合、アイコンは蓋が開いているまたは閉じて、チップの種類が挿入されているかどうかが表示されます。正しいポートが選択されていることを確認します。
- 蒸発を防ぐためにサンプルをロードするの5分以内にアッセイを実行します。
2。増幅とラベリング
マイクロアレイ解析の準備をするために、RNAサンプルは、T7 RNAポリメラーゼ3に基づく反応で、通常、増幅し、ラベルが付いています。二本鎖cDNAを逆転写によって生成されます。 cDNAは、cRNAをとして知られているものを生成するためのin vitro転写反応に使用されています。この反応は、アレイハイブリダイゼーションのためのラベルされたRNAのマイクログラム量を生産する、標識されたリボヌクレオチドの存在下で行われる。増幅/ラベリング方法の選択は、使用する後続のマイクロアレイプラットフォームに依存します。このセクションでは、Agilentのクイックアンプのラベリングキットを用いて蛍光標識したRNAの生成を説明します。
- 1.5 mlチューブに5μgのRNAにピペット50ngの。ボリュームは8.3μLを超えてはならない。必要に応じて、アルコールによる真空遠心分離や沈殿によりRNAサンプルを濃縮する。
- T7プライマー1.2μlを添加する。
- RNaseフリー水11.5μlの最終容量にもたらす。
- ° Cで10分間RNAを変性させ65℃でインキュベートする。我々は、チューブの上に結露を防ぐために熱い蓋付きサーマルサイクラーを使用することをお勧めします。
- 10分間のインキュベーション、暖かい5Xファーストストランドバッファー中に80℃で5分間。渦とスピンダウン。使用する準備ができるまで室温で保管してください。
- 10分間のインキュベーションの後、すぐに氷上に変性RNAサンプルクールダウン。
- cDNAのマスターミックスを調製する。反応ごとに、次の行を追加します。
- 4μlの5 ×ファーストストランドバッファー
- 2μlの0.1 M DTT
- 1μlの10mMのdNTPを
- 1μlのMMLV - RT酵素
- 0.5μlのRNaseのアウト。
- 転倒混和4倍して、コンポーネントを混在させること。ボルテックスしないでください。チューブの下部にコンテンツを収集するためにスピンダウン。
- サンプルあたりマスターミックスの8.5μlを添加する。上下ペッティングにより混和する。
- 40℃で2時間インキュベート℃、65℃で10分間、続い℃に我々は、加熱蓋付きサーマルサイクラーを使用することをお勧めします。
- 5分間氷にチューブを移す。
- 転写のマスターミックスを調製する。反応ごとに、次の行を追加します。
- 15.3μlヌクレアーゼフリーの水
- 20μlの4X転写バッファー
- 6μlの0.1 M DTT
- 8μlの次のNTP
- 6.4μlの50％のPEG（PEGを40℃に加温と再懸濁を確保するためにボルテックスしてください）
- 0.5μlのRNaseのアウト
- 0.6μlの無機ピロホスファターゼ
- 0.8μlのT7 RNAポリメラーゼ
- 2.4μLのCy3 -もしくはCy5 CTP
- 簡単に言えばチューブの下部にコンテンツを収集するサンプルをスピン。
- サンプルあたりの転写マスターミックス60μlを添加する。
- 2時間、40℃でインキュベートする。
- RNaseフリー水20μlを添加する。
- 取り込まれなかったヌクレオチドを除去するために標識cRNAを精製する。我々は、QiagenのRNeasyミニカラムを使用することをお勧めします。
- 標識cRNAを定量化する。我々は、マイクロアレイ測定モードでNanoDrop2000分光光度計を使用することをお勧めします。あなたがサンプルタイプとしてRNA - 40を選択してください。
- 記録のサンプルの濃度、収率（体積を掛けた濃度として計算）と比活性（cRNAの濃度以上の色素濃度の飼料を掛けた1000と計算される）。マイクロアレイハイブリダイゼーションのために、それは少なくとも825 ngおよび少なくとも8ピコモル/μgの比活性の収率を達成するために必要です。
3。マイクロアレイハイブリダイゼーション
- ハイブリダイゼーションが始まる℃で少なくとも2時間前に65℃のハイブリダイゼーションステーションとセットの電源をオンにします。
- ハイブリダイゼーションの試料を調製するために、1.5 mlチューブに次のように混ぜる。
- 825 ngのCy3標識cRNAを（これは通常あなたの"治療"のサンプルです）
- 825 ngのCy5標識cRNAを（これは通常あなたの"リファレンス"のサンプルです）
- 11μlの10倍のブロッキング剤。
- 52.8μlの最終容量にRNaseフリー水を追加します。
- 2.2μlの断片化バッファーを追加します。
- 混在させる低速で渦。
- 60℃を正確に30分間インキュベートします。これは、アレイハイブリダイゼーションのためにラベルされた断片を生成するcRNAの断片化のステップ、です。それはまさに前述のようにインキュベートすることは非常に重要です。我々は、加熱蓋付きサーマルサイクラーを使用することをお勧めします。正確な平均の長さのプローブを生成するために説明するとおりにインキュベートすることは非常に重要です。過度または不十分な断片化は、偽陰性または偽陽性になります。
- 断片化を停止するには、2Xハイブリダイゼーション緩衝液の55μlを添加します。気泡を導入しないように特別に注意しながら、ピペッティングして混ぜる。
- チューブの下部にコンテンツを収集するために最大速度で1分間遠心。気泡が認められた場合には、それらを削除するのに時間遠心してください。
- 光から保護され、チューブを氷上に置きます。できるだけ早く配列にサンプルをロードします。
- 配列をロードするには、最初のハイブリダイゼーションチャンバーを用意。このプロトコルは、ロシュ、NimbleGen社のハイブリダイゼーションシステムとA4のミキサー室とAgilentの4x44K配列を使用する方法を説明します。
- 組立/分解ツールは、最初のバーコード側のマイクロアレイスライドを置きます。
- A4サイズのミキサーを開いて、接着剤を公開。配列およびアセンブリ/どんな動きを防ぐために、分解ツールを保持する、遠端から始まる、スライド上にA4のミキサーを置きます。それが正しくツールに沿っていることを確認します。アレイのすべてのスライドに沿ってミキサースティック。
- スライド/ミキサーアセンブリを削除するには、ミキサーの端から引き出します。
- brayingツールを使用して、それがしっかりとtheslideに接着されていることを確認するために接着剤ガスケットに沿ってすべてのキーを押します。接着剤とスライドの間に閉じ込められた小さな気泡は、暗い背景に見ることができます。 brayingツールでこれらの気泡を除去するために余分な時間がかかる。配列には、現在ロードする準備ができています。
- ハイブリダイゼーションの試料100μlをロードするために容積式ピペットを使用してください。ポートの穴の内側にしっかりと先端を押してから、空気が配列領域にトラップされないようにゆっくりとスムーズに分注。バックアップのサンプルを吸うしようとしないでください。試料全体が調剤されると、プランジャーを解放せずにポートの穴に先端を保つ。サンプルは、配列全体をカバーし、液体がベントポートから出てきます起動すると、迅速にピペットを取り外します。先端が離れてスライドからになると、唯一のプランジャーを解放。
- 両方のポートで優しく軽く余分な液体。あなたがチャンバー自体のサンプルを引き出していないことを確認してください。
- ピンセットを使って、ステッカー付きポートの穴をカバーしています。
- ハイブリダイゼーションステーションでスライドを入れ、膀胱の穴は正確にO -リングの上に置かれていることを確認してください。これは、ハイブリダイゼーション中に混合適切な保証されます。
- スライドカバーとステーションのカバーを閉じます。ミキシングモードBにステーションを設定する
- ℃で17時間を65で配列をハイブリダイズさせる。
- 0.005％の最終濃度にトリトンX - 102を追加することによって、バッファ2を洗う準備する。 37℃で一晩おいてください。
4。マイクロアレイの洗浄
- 0.005％の最終濃度にバッファー1を洗浄するためにトリトンX - 102を追加。部屋のtemperaturでおいてくださいE.
- ハイブリダイゼーションが終了すると、洗浄バッファー1でガラス皿"A"をご記入ください。料理は、アセンブリ/分解工具を保持し、同様にいくつかの駆け引きを可能にするために十分な大きさにする必要があります。すべての洗浄は、ガラス製品で行う必要があります。彼らは、配列内の高いバックグラウンドで結果浸出物に傾向があるので、プラスチック製の皿を避けてください。
- 染色皿"B"のスライドラックと攪拌棒を置く。それはラックをカバーすることを確認し、洗浄バッファー1で埋める。室温で撹拌プレート上での場所。
- 空の染色皿"C"と撹拌プレート上での場所での攪拌棒を置く。
- アレイを削除し、組立/分解ツールでそれを置く。料理"A"に浸し、アセンブリ全体を。
- 慎重にA4ミキサーを剥がし、片手で反対側から取り付け/取り外しツールとスライドを保持している間。もし配列の領域を傷つけたりしないことを確認してください。
- 素早く料理"Bを"染色のラックにスライドを配置する。 Cy5の色素がオゾンに敏感なので、今から、空気への曝露を最小限に抑える必要があります。一度に8つ以上のアレイを洗浄しないでください。
- 中速で攪拌しながら1分間洗浄する。
- 予め温めておいた洗浄バッファー2で染色皿"C"を記入します。スライドを移し、1分間洗浄。
- 非常にゆっくりとスライド上に取り残された液滴を最小限にする料理"C"を染色からスライドラックを取り外します。
- 2分間回転させてスライドを乾燥させる。互換性のある遠心機が利用できない場合、50 mlコニカルチューブにスライドを遠心またはそれ以上のアルゴンガスを吹く。
- 50 mlコニカルチューブの代わりにスライドし、アルゴンガスで塗りつぶす。信号の損失を避けるためにすぐにスキャン。我々は、分子デバイスからGenePix 4000Bスキャナーの使用をお勧めします。
5。代表的な結果：
品質管理のためにバイオアナライザで実行すると良い品質のトータルRNAサンプルは、2つの主要なリボソームRNA種に相当する、唯一の二つの主要なピークを生成する必要があります。いくつかのRNAの分解は、最初のリボソームRNAのピーク前にスメアとして表示されます。 2リボソームRNAのピークが非常に低い強度またはまったく識別がされる一方でパフォーマンスが著しく低下し、低品質のRNAは、低保持時間でブロードなピークまたはピークのシリーズが表示されます。 2100バイオアナライザの出力の例については、図1を参照してください。
エキスパート2100ソフトウェアは、RNAの品質の定量的な測定として、RNAの完全性の数、またはRINを計算します。高品質のサンプルは、9よりも高いRIN値で、マイクロアレイのアプリケーションに最適明らかです。しかし、我々は合理的な品質のマイクロアレイデータを生成するには5.2という低いRIN値でのサンプルを使用している。
良い品質の配列は、比較的低いPMT値で高信号を生成する必要があります。私たちの実験では、転写産物のほとんどは、実験とリファレンスサンプル中の同じようなレベルで存在することが期待され、遺伝子発現の大規模な、広範囲に変化はおそらく生物学的意義にも支障を来たしてしまう。したがって、配列のほとんどは黄色ではなく、緑色または赤色になるはずです。良好な品質の信号はまた、ダイナミックレンジで信号のヒストグラムが完全に重なるようなものであるべきである。例については、図2を参照してください。
図1人間の脳の腫瘍組織から分離されたfour RNAサンプルの例。 RNAは、3.1.1で紹介したプロトコルを用いて単離した。サンプルの品質は、3.1.3で説明されているRNAの6000チップで2100バイオアナライザを用いて評価した。サンプルは、4つの異なるRNAの質の代表的なものである：非常に良いRNAの品質（RIN> 9）、B、部分的に分解したRNA（RIN 5-6、28S rRNAのための有意に低いピークに注意）、C、高度に分解したRNA（RIN < 3）、D、ほぼ完全に分解したRNA（RIN = 2）。私たちは、下流のマイクロアレイアプリケーション用に類似またはB（RIN> 5.2）より良い品質でサンプルを正常に使用している。ソリッドとオープン矢印はそれぞれ、18Sおよび28S rRNAの種の位置を示している。
図2配列の画像と散布図の例。 4X44K Agilentの形式で4つの配列を示し、全体のスライドプレビュー、、B、配列の領域の一つの高解像度スキャンでは、信号のどちらも（赤または緑）が支配的であることに注意して、C、の画像の散布図B、 信号が完全に重なって、これ以上-6 × 10以上の機能が飽和強度にあることに注意してください。
Discussion
DNAマイクロアレイによる発現プロファイリングは、2つの生物学的サンプル間の発現の異なる遺伝子を同定するための直接的なアプローチを提供します。成功した発現プロファイリング実験は、高品質なRNAサンプル、堅牢なラベリングとハイブリダイゼーションを必要とする。我々の経験では、Agilentから商業配列とラベリングキットは、妥当なコストで高品質なデータを提供しています。 Agilentはまた、独自のハイブリダイゼーションとスキャニング機構を提供する一方で、我々は、ロシュ、NimbleGen社と分子デバイスからGenePix 4000Bマイクロアレイスキャナーからハイブリダイゼーションシステムを好む。ロシュ- NimbleGen社のハイブリダイゼーションのユニットは、以前MAUIハイブリダイゼーションシステムとして知られていることに注意してください。ロシュによる最近の企業の買収後、A4のミキサーは廃止されました。これを書いている瞬間のように、彼らはまだそのようなKreatech診断（のような他の販売を通して見つけることができますwww.kreatech.com 、このウェブサイトはまた、便利な配列の互換性ツールを提供しています）が、長期在庫の有無は不明である。他のハイブリダイゼーションシステム（たとえば、アジレントから）使用できますが、配列が使用されて互換性のあるミキサーを見つけることができるなら、我々は、その品質と再現性のためにロシュ- NimbleGen社のシステムをお勧めします。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ジェームズS.マクダネル財団21 世紀アワードプログラム、およびNIHのディレクターの新イノベーター賞からEDへの補助金によって支えられている。 GABは、再生医療のカリフォルニア工科大学からポスドクによって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
| 2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
| Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
| Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
| Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
| Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
| A4 mixer hybridization chambers | |||
| Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
| Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
| Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
| Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
| Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
| GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
References
- Diaz, E. One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease. Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).
- Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).
- Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).
