Summary
우리는 신경계의 표현을위한 프로 파일링의 DNA microarrays의 사용을 보여줍니다. 우리는 RNA 품질 관리, 샘플 라벨링, 그리고 배열의 하이브리드화 및 검사에 대해 설명합니다.
Abstract
신경 계통의 Microarray 표현 프로 파일링은 일반적으로, 실험적으로 1 테스트중인 모든 조건 개발의 여러 단계, 여러 생리 또는 병적인 상태, 치료에 대한 응답에서 유전자 활동을 파악하고 강력한 방법을 제공합니다. 신경 조직의 표현 프로 파일링 고품질 RNA, 분리된 RNA와 DNA의 microarrays에 하이브 리다이 제이션의 증폭의 고립이 필요합니다. 이 문서에서 우리는 뇌 종양 조직 2 재현할 microarray 실험을 위해 프로토콜을 설명합니다. 우리는 애질런트의 2100 Bioanalyzer "실험실 - 온 - 어 - 칩 '기술로 고립 RNA 샘플의 품질 관리 분석을 수행하여 시작합니다. 고품질의 RNA 샘플은 microarray 실험의 성공을 위해 중요하고, 2100 Bioanalyzer은 샘플의 품질 빠르고 양적 측정을 제공합니다. RNA 샘플은 다음과 cDNA 증폭 얻기 위해 역방향 전송을 수행하여 라벨, 라벨 cRNA 생산 레이블 세포핵의 면전에서 체외의 전사에 의해 다음 있습니다. 듀얼 컬러 라벨 키트를 사용하여, 우리는 Cy3와 Cy5로 참조 샘플과 함께 실험 샘플 레이블을 것입니다. 두 샘플은 다음 결합과 애질런트의 4x44 K 배열에 hybridized 것입니다. 듀얼 - 색상 배열은 두 RNA 샘플은 하나의 microarray에 경쟁력 hybridized 때문에이를 표현 수준의 작은 변화에 대해 특히, 측정의 정확도를 증가 두 RNA 샘플 사이의 직접적인 비교의 장점을 제공합니다. 배열은 두 대응하는 파장에서 스캔되며, 각 기능에 대한 Cy3로 Cy5 신호의 비율은 해당 mRNA의 상대적인 풍요의 직접적인 측정으로 사용됩니다. 이 분석은 differentially 테스트중인 실험 조건에 대한 응답으로 표현됩니다 유전자를 식별합니다.
Protocol
1. 2100 Bioanalyzer와 RNA 샘플의 품질 관리 분석
당신이 시작하기 전에
- ° C 10 분 70에 사다리와 샘플을 변성. 얼음 즉시 칠.
- 10 초에 대한 RNase가없는 물이어서 1 분 RNaseZAP과 악기 전극을 청소하십시오. 공기 건조에 전극을 허용합니다.
- 키트와 함께 제공된 스핀 필터에 겔 매트릭스의 550 μl를 pipeting하여 겔 매트릭스를 준비합니다. 실온에서 10 분 1,500 RCF에서 원심 분리기. 나누어지는 최대 1 개월 4시 65 μl aliquots하고 저장 ° C로 젤을 필터링.
- 칩 마중물 역 준비하려면,
- 클립 통해 luer 잠금 어댑터에 1 - ML 주사기를 삽입합니다.
- , 받침대 아래에있는 나사를 느슨해진 접시를 운반하고 나사를 retightening하여 C를 위치로 기본 플레이트를 조정합니다.
- 최상위 순위에 주사기 클립을 조정합니다.
- 상온에 염료 집중 평형. 10 초위한 와동. 필터 젤의 65 μl 나누어지는에 염료 1 μl를 추가합니다. 잘 소용돌이와 실온에서 10 분 13,000 RCF에서 원심 분리기. 하루 만에 사용합니다.
당신이 샘플을 실행할 준비가되면, - 마중물 역에 칩을 놓습니다. 이 프로토콜에서는 RNA 6000 나노 칩을 사용하고 있습니다. 젤을로드하려면,
- 잘 검정색 배경에 흰색 "G"로 표시에서 젤 염색 믹스 피펫 9 μl. 귀하의 팁이 잘의 가장 하단에 위치하고 있는지 확인하십시오.
- 1 ML에서 주사기의 플런저를 놓습니다. 마중물 역을 닫습니다. 그것이 클릭 잠금 있는지 확인하십시오.
- 그것은 클립에 의해 개최 될 때까지 천천히 그러나 꾸준히 플런저를 누르십시오.
- 30 초 기다립니다. 클립을 놓습니다.
- 플런저가 스스로에 의해 가자. 그것이 움직이는 중지 후, 몇 초 동안 기다린 후 제 1 ML 위치로 플런저를 가져옵니다. 마중물 역을 엽니다.
- "G"로 표시된 2 개의 우물 각 젤 염색 믹스 피펫 9 μl.
- 12 샘플 우물 각과 잘 사다리에있는 마커의 피펫 5 μl.
- 잘 사다리에서 준비 사다리 피펫 1 μl.
- 샘플 우물에 각 시료의 피펫 1 μl.
- 잘 사용되지 않는 각각의 샘플에있는 마커의 피펫 1 μl.
- 와동 2,400 RPM에서 1 분 칩.
- , 칩을 실행하려면
- 2,100 전문가 소프트웨어를 시작합니다.
- 칩 위치하고 뚜껑을 닫습니다. 악기가 온라인 경우 아이콘이 뚜껑이 열려 있거나 닫혀 그리고 어떤 칩 종류의 삽입 여부가 표시됩니다. 올바른 포트가 선택되어 있는지 확인하십시오.
- 증발을 방지하기 위해 샘플을 로딩 중 5 분 이내에 분석을 실행합니다.
2. 증폭 및 라벨
microarray 분석을위한 준비하려면, RNA 샘플은 T7 RNA 중합 효소의 3을 기반으로 반응 일반적으로, 증폭 및 표시됩니다. 더블 리버스 녹음에 의해 생성되는이 cDNA 좌초. cDNA는 cRNA으로 알려진 것을 생성하는 시험 관내 전사 반응에 사용된다. 이 반응은 배열 하이브 리다이 제이션에 대한 분류 RNA의 마이크로 그램 수량을 생산, 레이블 ribonucleotides의 존재에서 수행됩니다. 확대 / 라벨링 방법의 선택은 사용할 이후 microarray 플랫폼에 따라 다릅니다. 이 섹션에서는, 우리는 애질런트의 빠른 앰프 라벨 키트를 사용하여 찬란 분류 RNA의 생성을 설명합니다.
- 1.5 ML 튜브에 RNA 5 μg을 피펫 50 NG. 볼륨 8.3 μl를 초과해서는 안됩니다. 필요한 경우, 알코올로 진공 원심 분리 또는 석출하여 RNA 샘플을 집중.
- T7 프라이머 1.2 μl를 추가합니다.
- RNase 무료 물로 11.5 μl의 최종 볼륨을 가져와.
- ° C 10 분 RNA를 변성 65에서 알을 품다. 우리는 튜브의 상단에 응축을 방지하기 위해 뜨거운 뚜껑과 thermocycler를 사용하는 것이 좋습니다.
- 10 분 부화, 따뜻한 배 퍼스트 스트랜드 버퍼 동안 80 ° C 5 분. 소용돌이와 스핀 다운. 사용할 때까지 RT에서 계속.
- 10 분 부화 후, 신속하게 얼음 변성 RNA 샘플 시원한 시간을 보내세요.
- cDNA 마스터 믹스를 준비합니다. 반응에 따라 다음을 추가 :
- 4 μl 배 퍼스트 스트랜드 버퍼
- 2 μl 0.1 M DTT
- 1 μl 10 MM의 dNTPs
- 1 μl MMLV - RT 효소
- 0.5 μl RNase 아웃.
- 반전 튜브 4 배로 구성 요소를 섞는다. 와동하지 마십시오. 튜브의 하단에있는 내용을 수집하는 스핀 다운.
- 샘플 당 마스터 믹스의 8.5 μl를 추가합니다. 최대 pipeting 아래로 섞는다.
- 40 2 시간에 대한 품어 ° C, 65 10 분 뒤에 ° C. 우리는 온수 뚜껑이있는 thermocycler를 사용하는 것이 좋습니다.
- 5 분 얼음 튜브를 전송합니다.
- 전사 마스터 믹스를 준비합니다. 반응에 따라 다음을 추가 :
- 15.3 μl nuclease없는 물
- 20 μl4X 전송 버퍼
- 6 μl 0.1 M DTT
- 8 μl NTPs
- 6.4 μl 50 % PEG (PEG가 40 ° C로 prewarmed 및 resuspension을 보장하기 vortexed해야합니다)
- 0.5 μl RNase 아웃
- 0.6 μl 무기 pyrophosphatase
- 0.8 μl T7 RNA 효소
- 2.4 μl Cy3 또는 Cy5 CTP
- 간단히 샘플은 튜브의 하단에있는 내용을 수집하는 스핀.
- 샘플 당 전사 마스터 믹스 60 μl를 추가합니다.
- 2 시간 40 ° C에서 알을 품다.
- RNase가없는 물을 20 μl를 추가합니다.
- 비법인 세포핵을 제거하기 위해 표시된 cRNA 정화. 우리는 Qiagen의 RNeasy 미니 컬럼을 사용하는 것이 좋습니다.
- 라벨 cRNA을 수량. 우리는 Microarray 측정 모드에서 NanoDrop2000 분광 광도계를 사용하는 것이 좋습니다. 이 샘플 형식으로 RNA - 40을 선택하십시오.
- 기록 샘플 농도, 이윤율 (볼륨 곱한 농도로 계산) 및 특정 활동 (cRNA 농도 이상의 염색 농도의 배급 곱한 1000로 계산). microarray의 하이브리드화 들어, 적어도 825 NG와 최소한 8 pmol / μg의 특정 활동의 수율을 달성하기 위해 필요합니다.
3. Microarray의 하이브리드화
- 65 하이브리드화 스테이션 및 설정를 켭니다 ° 하이브 리다이 제이션이 시작 C 최소한 2 시간 전에.
- 하이브 리다이 제이션 샘플을 준비하려면, 1.5 ML 튜브에 다음을 혼합 :
- 825 NG Cy3 - cRNA (이 일반적으로 "취급"예제입니다)
- 825 NG Cy5 - cRNA (이 일반적으로 "참조"예제입니다)
- 11 μl 10X 차단 요원.
- 52.8 μl의 최종 볼륨 RNase 무료 물을 추가
- 2.2 μl 조각 버퍼를 추가합니다.
- 혼합에 낮은 속도로 소용돌이.
- 60 ° C 정확히 30 분 알을 품다. 이것은 배열 하이브 리다이 제이션에 대한 라벨 조각을 생성 cRNA 조각화 단계입니다. 그것은 정확하게 설명 부화 매우 중요합니다. 우리는 온수 뚜껑이있는 thermocycler의 사용을 권장합니다. 그것은 정확하게 올바른 평균 길이의 프로브를 생성하는 설명 부화 매우 중요합니다. 과도하거나 부족 조각은 거짓 제외하거나 잘못 탐지가 발생합니다.
- 조각을 중지 2X 하이브리드화 버퍼 55 μl를 추가합니다. , pipetting 거품을 소개하지 특별한주의를 취하여 섞는다.
- 튜브의 하단에있는 내용을 수집하는 최대 속도에서 1 분 원심 분리기. 거품이 지켜지면, 그들을 제거하는 이상 원심 분리기.
- 빛으로부터 보호 얼음 튜브를 놓으십시오. 최대한 빨리 배열에 샘플을로드합니다.
- 배열을로드하려면 먼저 하이브리드화 챔버를 준비합니다. 이 프로토콜은 로체 - Nimblegen의 하이브리드화 시스템 및 A4의 믹서 챔버와 애질런트의 4x44K 배열의 사용을 설명합니다.
- 먼저 조립 / 해체 공구, 바코드 측면에서 microarray 슬라이드를 놓습니다.
- A4 믹서를 열고 접착제를 노출. 배열 및 조립 / 어떤 운동을 방지하기 위해 해체 도구를 개최, 맨 마지막에 시작, 슬라이드에 A4 믹서를 놓습니다. 그것이 제대로 도구에 정렬되어 있는지 확인하십시오. 모든 배열 슬라이드 따라 믹서를 지켜야합니다.
- 슬라이드 / 믹서 어셈블리를 제거하는 믹서의 마지막에서 당겨.
- braying 도구를 사용하여, 그것이 꽉 theslide에 붙어 있는지 확인하기 위해 접착 가스켓 따라 모두를 누르십시오. 접착제과 슬라이드 사이에 갇힌 작은 기포는 어두운 배경을 볼 수 있습니다. braying 도구를 사용하여 이러한 거품을 제거하기 위해 여분의 시간을 가지십시오. 당신의 배열은 지금 읽어 준비가되어 있습니다.
- 하이브 리다이 제이션 샘플 100 μl를 로드할 긍정적인 변위 피펫을 사용합니다. 단단히 포트 구멍 안쪽 끝을 밀어, 그 공기가 배열의 영역에 갇혀 아니라고 천천히 그리고 부드럽게 있도록 분배. 백업 예제를 빨아하려고하지 마십시오. 전체 예제가 적절되면 플런저를 발표하지 않고 포트 구멍에 제보를 유지. 예제는 전체 배열을 포함하고 액체 배출구를 나오기 시작하면, 신속하게 피펫을 제거합니다. 끝 멀리 슬라이드 출신 한 번만 플런저를 놓습니다.
- 두 포트에서 조심스럽게 소량 초과 액체. 당신이 챔버 자체의 샘플을 채취하지 않도록합니다.
- 핀셋을 사용하여 스티커와 포트 구멍을 커버.
- 하이브 리다이 제이션 역에 덮개를 씌우고, 그리고 방광 구멍이 올바르게 O - 링을 통해 위치가 결정됩니다 있는지 확인합니다. 이것은 하이브리드화하는 동안 적절한 혼합되도록합니다.
- 슬라이드 커버와 역 뚜껑을 닫습니다. 혼합 모드 B.로 역을 설정
- ° C 17시간 65에서 배열을 잡종.
- 0.005 %의 최종 농도 트리톤 X - 102을 추가하여 버퍼 2를 씻어 준비합니다. ° C 야간 37 유지.
4. Microarray 세척
- 0.005 %의 최종 농도 버퍼 1 씻어 트리톤 X - 102을 추가합니다. 객실 temperatur에서 보관E.
- 하이브 리다이 제이션이 완료되면, 워시 버퍼 1 유리 접시 "A"를 입력합니다. 접시는 조립 / 해체 도구를 잡고뿐만 아니라 일부 작전을 허용만큼 큰해야합니다. 모든 세척은 유리로 이루어 질 것입니다. 그들이 배열에 높은 백그라운드에서 발생 리치 화합물하는 경향이 있기 때문에, 플라스틱 요리를 피하십시오.
- 얼룩 요리 "B"의 슬라이드 랙 및 저어 막대를 넣어. 그것은 선반을 커버해야하고, 워시 버퍼 1 채웁니다. 상온에서 저어 접시에 놓습니다.
- 저어 접시에 빈 얼룩 요리 "C"와 장소에 저어 막대를 넣어.
- 배열을 제거하고 조립 / 해체 도구에 넣어. 요리 "A"에서 잠수함 온 회중합니다.
- 조심스럽게 A4 믹서에서 껍질, 한 손으로 반대편에서 조립 / 해체 도구 및 슬라이드를 누른 상태. 당신은 배열의 영역을 스크래치하지 않도록합니다.
- 신속하게 요리 "B"를 얼룩의 선반에 슬라이드를 놓습니다. Cy5 염료는 오존에 민감한 있기 때문에 지금부터, 공기에 노출을 최소화해야합니다. 한 번에 두 개 이상 8 배열을 씻지 마십시오.
- 중간 속도로 1 분 감동을위한 씻으십시오.
- 사전 예열 씻으 버퍼 2 요리 "C"를 염색법 입력합니다. 슬라이드를 전송하고 1 분 씻으십시오.
- 아주 천천히 슬라이드에 남아 방울을 최소화하기 위해 요리 "C"를 얼룩의 슬라이드 선반을 제거합니다.
- 2 분 동안 회전하여 슬라이드를 건조시킵니다. 호환 원심 분리기를 사용할 수없는 경우, 50 ML 원뿔 튜브 슬라이드를 원심 또는 이상의 아르곤 가스를 불어.
- 플레이스 50 ML 원뿔 튜브 슬라이드 및 아르곤 가스를 채우십시오. 신호 손실을 피하기 위해 즉시 스캔. 우리는 분자 장치에서 GenePix 4000B 스캐너의 사용을 권장합니다.
5. 대표 결과 :
2 주요 ribosomal RNA 종 대응, 품질 관리를위한 Bioanalyzer에서 실행하면 양질의 총 RNA 샘플은 두 가지 주요 봉우리를 생성해야합니다. 일부 RNA의 저하는 첫 번째 ribosomal RNA 피크 전에 얼룩으로 표시됩니다. 심각하게 저하될 2 ribosomal RNA의 봉우리가 전혀 매우 낮은 농도 여부 식별이 될 것입니다 반면, 낮은 품질의 RNA는 브로드 피크 또는 낮은 유지 시간에 봉우리의 시리즈를 표시합니다. 2100 Bioanalyzer 출력의 예를 들면, 그림 1을 참조하십시오.
전문가 2100 소프트웨어는 RNA 품질의 양적 측정으로 RNA 무결성 번호 또는 RIN을 계산합니다. 9 이상 RIN 값 고품질 샘플, microarray 애플 리케이션에 가장 분명합니다. 그러나, 우리는 합리적인 품질의 microarray 데이터를 생성 5.2만큼 낮은 RIN 값 샘플을 사용했습니다.
양질의 배열은 비교적 낮은 PMT 값을 높은 신호를 생성한다. 우리의 실험에서는, 기록의 대부분은 실험과 참조 예제에서와 비슷한 수준에 존재 것으로 예상되며 유전자 발현에 대규모, 광범위한 변화는 아마도 어떤 생물 학적 의미가없는 것입니다. 따라서, 배열의 대부분은 오히려 녹색 또는 빨간색보다 노란색 보일 것입니다. 양질의 신호는 신호 histograms 완전히 중복되는 같은 동적 범위에 있어야합니다. 예를 보려면 그림 2를 참조하십시오.
그림 1. 인간의 뇌 종양 조직으로부터 격리 사 RNA 샘플의 예. RNA는 3.1.1에 표시되는 프로토콜을 사용하여 격리되었다. 샘플 품질로 3.1.3에 설명된 RNA 6000 칩에 2100 Bioanalyzer를 사용하여 평가되었다. 샘플 4 별개의 RNA의 자질 대표하는 : A, 아주 좋은 RNA 품질 (RIN> 9), B, 부분적으로 저하 RNA (RIN 5-6, 28S rRNA에 대한 상당히 낮은 정상 주) C, 고도의 저하 RNA (RIN < 3), D, 거의 저하 RNA (RIN = 2). 우리는 하류 microarray 애플 리케이션을위한 비슷하거나 B (RIN> 5.2)보다 나은 자질을 가진 샘플을 성공적으로 사용했습니다. 솔리드 및 오픈 화살촉은 각각 18S와 28S rRNA 종의 위치를 나타냅니다.
그림 2. 어레이 이미지와 스캐터 플롯의 예. 4X44K 애질런트 형식으로 네 개의 배열을 보여주는, 전체 슬라이드 미리보기, B, 배열의 영역 중 하나의 고해상도 스캔은 신호의도 (빨간색 또는 녹색)가 주된있다는 점에 유의, C,에있는 이미지의 스캐터 플롯 B, 신호가 완전히 중복하고 더 이상 -6 1x10 이상의 기능이 포화 강도에됩니다.
Discussion
DNA의 microarrays와 표현 프로 파일링 두 생물 학적 샘플 사이 differentially 표현 유전자를 식별할 수있는 간단한 방법을 제공합니다. 성공적인 표현 프로 파일링 실험 고품질의 RNA 샘플, 강력한 라벨링과 하이브 리다이 제이션을 필요로합니다. 우리의 경험에서 애질런트의 상업 배열과 라벨 키트는 저렴한 비용으로 고품질의 데이터를 제공합니다. 애질런트는 또한 자신의 하이브리드화 및 스캐닝 기계를 제공하고 있지만, 우리는 로체 - Nimblegen 및 분자 장치에서 GenePix 4000B microarray 스캐너의 하이브리드화 시스템을 선호. 로체 - Nimblegen의 하이브리드화 장치가 이전 마우이 하이브리드화 시스템으로 알려져 있다고합니다. 로체가 최근 기업 인수 후, A4의 믹서가 중단되었습니다. 이 글을 쓰는 순간에, 그들은 여전히 같은 Kreatech 진단 (다른 판매자를 통해 찾을 수 www.kreatech.com ,이 웹사이트는 또한 편리한 배열 호환성 도구를 제공합니다)하지만, 장기 재고 여부는 불확실합니다. 기타 하이브리드화 시스템 (예를 들어, 애질런트에서) 제공되지만, 배열을 사용하고와 호환 믹서를 찾을 수있다면, 우리는 품질과 재현성에 대한 호슈 - Nimblegen의 시스템을 권장합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 제임스 S. 맥도넬 재단 21 세기 수상 프로그램에서 ED 부여, 그리고 NIH 원장의 새로운 이노 수상에 의해 지원되었다. 수다는 재생 의학의 캘리포니아 공과 대학에서 박사 화목에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
| 2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
| Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
| Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
| Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
| Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
| A4 mixer hybridization chambers | |||
| Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
| Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
| Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
| Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
| Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
| GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
References
- Diaz, E. One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease. Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).
- Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).
- Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).
