Summary
Методы визуализации биолюминесценции бактериальных инфекций в живых животных, описаны. Патогенные изменен, чтобы выразить люциферазы позволяет оптическим целого изображения тела инфекций у животных. Экспериментальные модели на животных могут быть инфицированы люциферазы выражения патогенов и в результате течения заболевания визуализированы в реальном времени биолюминесценции изображений.
Protocol
1. Легочная инфекция при интубации трахеи
- Взвесьте мышей и, дополнительно, отмечает могут быть сделаны на уши для облегчения идентификации.
- Обезболить мышей с кетамином (100 мкг на грамм веса мыши) и ксилазина (10 мкг на грамм веса мыши) путем внутрибрюшинного заражения.
- Место мышей в клетках до полной анестезии. Сожмите подушечки ног и проверить педали рефлекс. Мыши должны проявить уменьшена или не рефлекторную реакцию.
- Место мыши на интубации стоять лежать на спине.
- Fix резинкой на интубацию стоять, а затем поместить его под верхние резцы мыши. Используйте ленту, чтобы исправить ноги и руки на интубации стенда.
- Аккуратно переместите tougue из уст использованием щипцов.
- Вставьте зеркало с octoscope внутри рта и ротоглотки смотреть в гортань до открытия видна.
- Advance проводник покрытый cathether в трахею, пока catether концентратор на резцы. Удалить проводник. Положите воздуха в cathether наблюдать груди расширения и подтверждения правильности интубации.
- Inject 50 мкл бактериальной (в показанного на рисунке мы использовали Кальметта Герена (БЦЖ), выражающая нажмите жук красный люциферазы (CBRLuc), построенный в нашей лаборатории, но любая люминесцентного бактериального штамма может быть использован) раствор через cathether использованием 1 мл шприца.
- Место мыши в клетке, и наблюдать его во время восстановления после анестезии.
2. Обезболивания животных и подготовка к биолюминесценции изображений
Мыши под наркозом с использованием изофлуран XGI-8 Газ Aneshesia системы.
- Перед началом работы XGI-8 анестезии системы, взвешивать каждый угольный фильтр канистры и писать вес и дата на нем. Если вес составляет 50 грамм в течение от первоначального веса, замените его новым канистру.
- Проверьте изофлуран уровня в испарителе и заполнить его в случае необходимости.
- Включите эвакуации насоса в передней части XGI-8 анестезии системе и настроить до 8 литров в минуту (литров в minuite).
- Включите кислорода из цилиндра высокого давления и установить его на 55 фунтов на квадратный дюйм.
- Включите кислорода переключения (зеленый) на передней XGI-8 анестезии системы.
- Включить подачу газа изображения камеры, чтобы установить уровень потока газа. Установить до 0,25 литров в минуту, а затем выключить газовый поток.
- Включите потока газа в камеру вводного наркоза, чтобы установить уровень потока газа. Установить до 1,5 литров в минуту, а затем выключить газовый поток.
- Включите изофлуран с испарителем и настроен на 2-2,5 процента. Изофлуран уровня могут быть скорректированы в зависимости от количества животных используются и вес.
- Место мышей в индукции камеру и закрыть крышкой. Включить подачу газа индукции камеры. Место мышей в камере в течение 5 - 10 minuites, пока они не обезболить полностью.
- Применение оптических мазь для глаз, чтобы защитить мышь глаз во время съемки и место мышей в камере изображений в одном из головных частей на анестезию многообразия. Используйте легкую перегородку между мышами, чтобы предотвратить отражение света на соседние предметы животного.
- Inject люциферин (150 мкг / г веса тела) путем внутрибрюшинного заражения.
3. Биолюминесценция изображений
- Запустите программу Жизнь Imaging.
- Если в системе не инициализирована, инициализации системы ИВИС Imaging.
- Установите параметры для работы с изображениями, щелкнув последовательность установки в панели управления ИВИС приобретения.
Выберите люминесценции и фотографии в режиме Imaging. Если возможность осуществлять DLIT 3D реконструкции требуется, выберите фотографические, люминесцентные и структурных свет картинки как часть последовательности изображений.
Установить время экспозиции от 0,5 сек до 10 минут.
Установить Биннига и F / остановка на основе ожидаемой яркости образца.
Установить фильтр для возбуждения блока и выбросов фильтр, чтобы открыть, если только планирует приобрести только определенные длины волн света. В случае DLIT 3D конституцию, установить несколько фильтров излучения с различными длинами волн позволяют точно определять локализацию источника.
Установить FOV от А до D в зависимости от количества мышей или регион животных для включения в образ. Выберите и В в течение 1 мышь, С в течение 2-3 мышей и D в течение 4-5 мышей. - Нажмите кнопку Добавить в Image Wizard в панели управления Приобретение добавить последовательность установки.
- Начало отображающей последовательности, нажав приобрести.
В случае строительства DLIT 3D, люминесцентные изображения будут приобретены за несколько фильтров излучения на разных длинах волн. Фото-и структурированный свет изображения также будут приобретены. - Во время приобретения изображений и редактирования изображений уровней панели будут видны. Заполните также подробную информацию насколько это возможно для каждого эксперимента в редактировать изображения для обеспечения легкого отслеживания изображения на более позднее время и сохранять изображения.
- ReRemove мышей от ИВИС изображения камеры и вернуть их в клетках. Соблюдайте восстановлениеэстезия обеспечить мышей не были существенно затронуты процедурой. Животные должны быть под постоянным контролем, пока они полностью восстановиться от анестезии (обычно 1-2 мин).
4. Бывших естественных изображений и КОЕ анализа для количественного бактерий в легких
- Inject мышей с люциферин внутрибрюшинно в том же порядке, как для работы с изображениями, только до эвтаназии.
- Усыпить мышей при введении препарата в дозе 100 мг / кг pentobarbitol 5 мин после инъекции люциферин.
- Эксплантов легкие от мышей и поместить в стерильный Петри, блюда с использованием стерильного пинцета и ножниц.
- Место Петри-блюдо с эксплантированных орган в области обработки изображений камеры и приобрести биолюминесценции изображения так же, как и для целого мыши.
- После обработки изображений, удалять эксплантированных органа из чашки Петри использованием стерильных щипцов и гомогенизации в 1 мл PBS.
- Сделать разведения и пластины ткани на соответствующих селективных средах. Усредненные ткани могут быть сохранены -80 ° C для повторного покрытия в случае необходимости. Кроме того, гомогенизированные ткани могут быть использованы для РНК или ДНК добычи количественно бактериального чисел КПЦР.
5. Анализ люминесценция изображений
- Старт "Программное обеспечение Жизнь изображений" и просматривать файлы изображений.
- Используйте "Палитра инструментов" для регулировки изображения. Нажмите Настройка изображения, изменять коррекции / параметры фильтрации и мин / макс для отдельных шкал цвета.
- Используйте ROI инструментов в выпадающем списке для количественной оценки интенсивности света. Выберите ROI форма, количество и размер. Перетащите ROI кадр область интереса на изображении. Убедитесь, что все ROI имеют одинаковый размер и форму. Нажмите ROI измерения и сохранять, копировать и / или экспорт количественных данных.
- В случае DLIT 3D реконструкции, нагрузка последовательность изображений, включая структурированные изображения света. Нажмите топографии поверхности в инструмент Платт. В раскрывающемся списке, щелкните вкладку Реконструкция для создания рельефа поверхности. Поверхности беспорядок появится в окне.
- Выберите DLIT 3D реконструкции в инструмент Платт. В выпадающем списке, перейдите на вкладку Свойства установить свойства тканей и источник спектра. Мышцы рекомендуется в большинстве случаев. В раскрывающемся списке, щелкните вкладку анализ, чтобы выбрать длину волны для анализа. Щелкните вкладку Параметры и подтвердите значения по умолчанию или настроить параметры DLIT если это необходимо. Щелкните вкладку реконструкция начать 3D анализ.
- Когда 3D-реконструкция закончится, 3D вид будет отображать результаты 3D-реконструкции. Нажмите результатов вкладку, чтобы увидеть анализ данных по плотности фотонов, вокселей и DLIT параметры алгоритма.
- Сохранить и / или экспорт результатов анализов 3D реконструкции в цифры и файлов данных.
6. Представитель Результаты:
Биолюминесценции изображения мышей, инфицированных бактериями биолюминесцентного вместе с неинфицированными управления мышью, показаны на рисунке 1. Мышей легочная инфицированных биолюминесцентного бактерии производят значительный сигнал от легких (рис. 1). Интенсивность люминесценции количественно, как полный поток в пределах ROI (область заинтересована) (рис. 2). Количественные данные об интенсивности света нормирован для колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, полученных из легких, чтобы подтвердить, что сигнал вырабатывается из биолюминесценции бактерий и может быть по сравнению с отрицательным контролем. Расположение и интенсивность сигнала может быть дополнительно проанализировать DLIT 3D-реконструкция люминесценции источник на основе томографии мышью поверхности 11. Эти анализы позволяют количественного и локализации биолюминесцентного сигнала производится. Результаты 3D-реконструкция люминесцентный источник в зараженных мышей показывает, что свет изготавливается из легких мыши (рис. 3). Бывший изображений естественных условиях в результате мыши легких подтверждают, что свечение излучается из легких, а не некоторые связанные с сопоставляются ткани или органа (рис. 2С).
Рисунок 1. Люминесценция визуализации легких зараженных мышей с биолюминесценции бактерий с меткой CBRluc. Неинфицированные управление мышью находится на левой и два инфицированных мышей справа. Мыши были заражены бактериями выражения CBRluc (п = 2) через трахею маршрута. Через 10 минут после инъекции люциферин, люминесценция изображения были получены в течение 10 мин при 4 позиции: спинной, брюшной, левая сторона и правая сторона.
Рисунок 2. Количественной интенсивности света от мышей, инфицированных бактериями выражения CBRluc. (А, В) Люминесценция образы ROI анализ и количественно суммарный поток света от ROI в спинной и брюшной позиции, соответственно. Неинфицированных мышей слева и два инфицированных мышей справа. Люминесценция изображения были получены из легких ое мышей неинфицированных и инфицированных CBRlux (п = 2). Интенсивность света вокруг легких была количественно путем анализа ROI. C), исключая виво изображения легких от неинфицированных (вверху) и инфицированных (внизу два ряда легких) у мышей. Люциферин вводили 5 miniuts до эвтаназии и изображения были затем приобретены. Количественные значения нормированы на КОЕ.
Рисунок 3. 3D-реконструкция биолюминесценции источника (ов) от легочной инфицированные мыши. Мышь была заражена бактериями выражения CBRluc по интратрахеального инъекции. Последовательности изображений было приобретено с использованием различных фильтров выбросов серийного длин волн от 540 нм до 700 нм. Последовательности изображений было использовано для восстановления 3D для люминесценции источник в животное предметов, содержащих структурированные мнимой. ) Томографии для мыши показан в различных положениях: спереди, сзади, слева и справа. Источники света, показаны как вокселей (красные коробки внутри мыши 3D), которые находятся в легких, как это определено реконструкции. Б) Фотон densiy карту измеренных и модельных данных. Сравнение измеренных и моделирование кривых плотности фотонов предоставить информацию о качестве реконструкции. Хорошее качество реконструкции результата в подобных измеряется и моделирование фотонных плотностей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя следующие протоколы, как правило, приводят к высоким качеством изображения, важно учитывать несколько ключевых вопросов, чтобы получить точные и согласованные данные из изображений исследований. Люминесценция изображения должны быть приобретены, которые насчитывает от 600 до 60000, чтобы сигнал выше фона и камера не насыщен. Если сигнал, полученный меньше 600 от условий эксплуатации должны быть приспособлены для увеличения рассчитывает. Если сигнал, получаемый составляет более 60 тысяч камер насыщается в некоторых регионах. Когда камера насыщенным, количественного не должно быть предпринято в насыщенных регионах, хотя все еще возможно, а иногда и необходимо в ненасыщенных регионах. Кроме того, 3D-реконструкция не может осуществляться точно, когда насыщенных регионов включена в регионе используется для маски для реконструкции. Регулировка времени экспозиции, биннинга и F / остановка для получения изображений, а также изменение области изображения или животного позиции может контролировать сигнал, полученный и позволяют количественного анализа данных. Таким образом, во многих экспериментах было бы полезно последовательно изображения животных в нескольких условий экспозицию, чтобы гарантировать, что хотя бы один набор образов будет в требуемых пределах, чтобы количественного анализа.
Важно помнить, что выражение какого-либо гена-репортера могут повлиять на вирулентность, что делает необходимым провести экспериментальные исследования для оценки потенциального воздействия на фитнес в рекомбинантов штаммы, которые будут использоваться для работы с изображениями. Это одно из ограничений изображений биолюминесцентного, так как он требует выражения чужеродных генов в бактерии. Это часто может быть преодолено с помощью оптимизированной конструкции, использующие надлежащего использования кодона для видов бактерий для изучения, титрование уровни экспрессии генов для репортера, чтобы уменьшить влияние на обмен веществ и изучении нескольких люминесцентных системы репортера, которые могут отличаться по своему воздействию по фитнесу.
Другой основной переменной для работы с изображениями исследования с инфекционными агентами, является уровень сигнал, агент образ. Поскольку Есть различия в порог обнаружения для каждого агента на животных по сравнению с в пробирке, рекомендуется, чтобы пилотные исследования с использованием нескольких инфекционных доз для оптимизации агент номера до проведения более широких экспериментов. Биолюминесцентного журналистам сами также должны быть оптимизированы для токсичности транскрипции, трансляции и низким, чтобы гарантировать, что уровень сигнала, столь же высока, как это возможно. Оптимизация журналистам может быть достигнуто в большинстве случаев в пробирке, но длина волны светового излучения также будет влиять на способность свет, излучаемый оптимального журналистам проникнуть ткани млекопитающих, поэтому важно также оценить различные журналистам непосредственно у животных. Хотя каждое животное может следовать индивидуально, что контроль за большой изменчивости между животными, все равно необходимо включить достаточное животных, чтобы статистически значимые различия между группами, которые будут определены. Как правило, количество животных должно быть 4 - 6 в группе, что позволяет различия столь же низко, как два раза между группами, которые должны соблюдаться во многих случаях. Наконец, маршрут прививки и точность доставки в соответствующие ткани и точные цифры агент поможет обеспечить устойчивые результаты, уменьшая общую изменчивость между животными.
Спектральные свойства биолюминесценции производства также является важным фактором, влияющим на способность изображения инфекции в естественных условиях. В тканях млекопитающих, света длиной волны меньше 600 нм в значительной степени поглощается гемоглобином, основным компонентом тканей млекопитающих. Глубина проникновения для биолюминесценции длин волн резко увеличивается на длинах волн более 600 нм 8,12. Оба CBRluc и FFluc производить биолюминесценции с широким длин волн, в том числе более 600 нм, что делает эти люцифераз почти идеальной журналистам для прижизненного изображения, даже в глубоких тканях, включая легкие и печень 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Исследования на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитета Техас & M University.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Cirillo лаборатории членов за ценные обсуждения и помощь на протяжении всего этого исследования. Мы благодарим доктора Джошуа Хилл и лаборатории д-р Джеймс Сэмюэль за помощь во время съемок этого протокола. Эта работа финансировалась грантом 48523 от Фонда Билла и Мелинды Гейтс и предоставить AI47866 из Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| Ketamine | Butler Animal Health Supply | ||
| Xylazine | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | |
| Fetal plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Cathether (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | ||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | ||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | ||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
References
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
- Wet, J. R. de, Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
- Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
- Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).
