Summary
Metoder för bioluminescence avbildning av bakteriella infektioner i levande djur beskrivs. Patogener är modifierade att uttrycka luciferas tillåta optiska hela kroppen avbildning av infektioner hos levande djur. Djurmodeller kan vara infekterade med luciferas uttrycka patogener och den därav sjukdomens förlopp visualiseras i realtid med bioluminescens avbildning.
Abstract
Imaging är en värdefull teknik som kan användas för att övervaka biologiska processer. I synnerhet kan förekomsten av cancerceller, stamceller, specifika immunförsvaret celltyper, virala patogener, parasiter och bakterier följas i realtid i levande djur 1-2. Tillämpning av bioluminescens imaging till studiet av patogener har fördelar jämfört med konventionella strategier för analys av infektioner i djurmodeller 3-4. Infektioner kan visualiseras inom enskilda djur över tid, utan att kräva dödshjälp att bestämma var och mängden av den sjukdomsalstrande. Optisk avbildning gör omfattande granskning av alla vävnader och organ, snarare än provtagning av platser som tidigare kända för att vara smittade. Dessutom kan riktigheten av ympning på specifika vävnader vara direkt bestämmas innan överföring av djur som utan framgång har inympats i hela experimentet. Variation mellan djur kan styras för, eftersom bildbehandling gör att varje djur som skall följas individuellt. Imaging har potential att kraftigt minska djurens antal behövs på grund av möjligheten att få data från flera tidpunkter utan att behöva prov vävnader för att bestämma sjukdomsalstrande belastning 3-4.
Detta protokoll beskriver metoder för att visualisera infektioner i levande djur använder bioluminescens bildhantering för rekombinanta stammar av bakterier uttrycka luciferas. Det Klicka skalbaggen (CBRLuc) och Firefly luciferases (FFluc) utnyttja luciferin som substrat 5-6. Ljuset som produceras av både CBRluc och FFluc har en bred våglängd från 500 nm till 700 nm, vilket gör dessa luciferases utmärkta reportrar för optisk avbildning i levande djurmodeller 7-9. Detta beror främst på våglängder av ljus är större än 600 nm krävs för att undvika absorption av hemoglobin och därmed resa genom däggdjur effektivt. Luciferas är genetiskt förs in i bakterier för att producera ljussignal 10. Möss är pulmonell inokuleras med självlysande bakterier intratracheally att tillåta övervakning av infektioner i realtid. Efter luciferin injektion, är bilder förvärvats med hjälp av IVIS Imaging System. Under bildbehandling, möss sövda med isofluran med ett XGI-8 Gas Anethesia System. Bilderna kan analyseras för att lokalisera och kvantifiera signalkälla, som representerar bakteriell infektion (n) och antal, respektive. Efter bildbehandling är CFU beslutsamhet utförs på homogeniserad vävnad för att bekräfta förekomsten av bakterier. Flera doser av bakterier används för att korrelera bakteriella nummer med luminiscens. Imaging kan tillämpas på studier av patogenes och utvärdering av effekten av antibakteriella substanser och vacciner.
Protocol
1. Lunginfektion vid intratrakeal Intubation
- Väg möss och eventuellt kan märken göras på öronen för enkel identifiering.
- Bedöva möss med ketamin (100 mikrogram per gram mus vikt) och xylazin (10 mikrogram per gram mus vikt) efter intraperitoneal ympning.
- Placera möss i bur tills den är helt sövd. Pressa kuddar av deras fötter för att kontrollera pedalen reflex. Möss bör visa minskad eller ingen reflex reaktion.
- Placera musen på intubering stå liggande på rygg.
- Fäst ett gummiband till intubation stå och sedan placera den under den övre incisiverna av musen. Använd tejp för att fixa ben och armar på intubering monter.
- Rör försiktigt Tougué ut ur munnen med hjälp av pincetten.
- Sätt spekulum med octoscope insidan av munnen och ser in i orofarynx förrän struphuvudet öppningen syns.
- Advance guidekabel täckt med cathether i luftstrupen förrän catether nav är på framtänderna. Ta bort guidekabel. Sätt in luft i cathether att observera bröstet expansion och bekräfta korrekta intubering.
- Injicera 50 mikroliter av bakteriell (i de bilder som visas har vi använt Bacillus Calmette Guerin (BCG) som uttrycker klicka skalbagge röda luciferas (CBRLuc), konstruerat i vårt laboratorium, men alla självlysande bakteriestam kan användas) lösning genom cathether använda en 1 ml spruta.
- Placera musen i en bur och observera den under återhämtning från anestesi.
2. Animal Anesthetization och förberedelser för mareld Imaging
Möss är sövda med isofluran med XGI-8 Gas Aneshesia System.
- Innan du använder XGI-8 anestesi-system, väga varje kolfilter behållare och skriva vikt och datum på den. Om vikten är 50 gram över av den ursprungliga vikten, ersätta den med en ny kapsel.
- Kontrollera isofluran nivå i förångaren och fylla den om det behövs.
- Slå på evakueringen pump i framsidan av XGI-8 anestesi system och ställa till 8 l (liter per minuite).
- Slå på syretillförseln från högt tryck cylinder och sätta den till 55 psig.
- Slå på syre växla (grön) på framsidan av XGI-8 anestesi-system.
- Slå på gasflöde till avbildning kammaren för att ställa in graden av gasflödet. Inställd på 0,25 l och sedan stänga av gasflödet.
- Slå på gasflöde till anestesi induktion kammaren för att ställa in graden av gasflödet. Ställ in på 1,5 l och sedan stänger av gasflödet.
- Slå på isofluran med förångaren och inställd på 2-2,5 procent. Den isofluran kan justeras beroende på antalet djur som används och vikt.
- Placera möss i induktion kammaren och stäng locket. Slå på gasflödet till induktion kammare. Placera möss i kammaren för 5 till 10 minuites tills de är söva helt.
- Applicera optiska salva till ögonen för att skydda musen ögonen under bildbehandling och placera möss i bildbehandling kammare i ett av näsan kottar på anestesi grenröret. Använd ljus baffel mellan möss för att förhindra att återkasta ljus på angränsande djurförsök.
- Injicera luciferin (150 mikrogram / gram kroppsvikt) efter intraperitoneal ympning.
3. Bioluminescence Imaging
- Starta programmet Living Imaging.
- Om systemet inte har initierats initiera IVIS Imaging System.
- Ställ in parametrarna för avbildning genom att klicka sekvens setup i IVIS förvärv kontrollpanelen.
Välj luminiscens och fotografera i Imaging läge. Om alternativet att utföra DLIT 3D-rekonstruktion önskas, välj fotografiska, självlysande och strukturella ljus bild som en del av bildsekvensen.
Ställ in exponeringstid från 0,5 sek till 10 minuter.
Ställ Binning och F / stanna baserat på förväntade ljusstyrka prov.
Ställ excitation filter för att blockera och utsläpp filter för att öppna, om inte planerar att köpa endast vissa våglängder av ljus. Vid DLIT 3D-konstitution, som flera utsläpp filter av olika våglängder för att ge exakt lokalisering av källa.
Ställ FOV från A till D beroende på antalet möss eller region djur som skall avbildas. Välj A och B för en mus, C 2-3 möss och D för 4-5 möss. - Klicka på Lägg till i Image Wizard i förvärvet Kontrollpanelen för att lägga till sekvensen setup.
- Starta avbildning sekvensen genom att klicka förvärva.
Vid DLIT 3D-konstruktion, kommer självlysande bilder att förvärvas för flera utsläpp filter vid olika våglängder. Fotografisk och strukturerat ljus bilder kommer också förvärvas. - Under förvärv bilden och redigera bild nivåer paneler kommer att vara synlig. Fyll i så detaljerad information som möjligt för varje experiment i redigera bilden för att säkerställa enkel spårning av bilder vid senare tillfällen och spara dina bilder.
- ReRemove mössen från IVIS avbildning kammare och återföra dem till sina burar. Observera återhämtning från enesthesia att se mössen påverkades inte signifikant av förfarandet. Djur bör övervakas hela tiden tills de är helt återhämta sig från anestesi (vanligen 1-2 minuter).
4. Ex vivo Imaging och CFU analys för kvantifiering av bakterier i lungorna
- Injicera möss med luciferin intraperitonealt på samma sätt som för bildbehandling, strax före eutanasi.
- Euthanize möss efter intraperitoneal injektion av 100 mg / kg pentobarbitol 5 min efter luciferin injektion.
- Explantation lungorna från möss och plats i sterila petriskålar-rätter med hjälp av steril pincett och sax.
- Placera petri-skålen innehåller explanterade orgeln i bildbehandling kammare och förvärva mareld bilder på samma sätt som för hela mus.
- Efter bildbehandling, ta bort explanterade orgel från petriskål med steril pincett och homogenisera i 1 mL PBS.
- Gör spädningar och plåt vävnad på lämpliga selektiva medier. Homogeniserad vävnaden kan lagras -80 ° C för nytt förkromning bör det vara nödvändigt. Alternativt kan homogeniserad vävnad användas för RNA eller DNA-extraktion att kvantifiera bakteriell nummer med qPCR.
5. Analys av Luminescence Imaging
- Starta "Programvara Living Imaging" och bläddra i bildfiler.
- Använd "verktygspaletten" för att justera bilderna. Klicka på bilden Anpassa ändra korrigering / filtrering inställningar och min / max för enskilda färgskalor.
- Använd ROI verktyg i rullgardinsmenyn lista för kvantifiering av ljusintensiteten. Välj ROI form, antal och storlek. Dra ROI ram till regionen av ränta på bilden. Se till att alla ROI har samma storlek och form. Klicka på ROI mätning och spara, kopiera och / eller export kvantitativa data.
- Vid DLIT 3D rekonstruktioner, ladda bildsekvens inklusive strukturerat ljus bild. Klicka yttopografi i Tool Platte. I rullgardinsmenyn klickar Rekonstruera flik för att generera yttopografi. En yta mess visas då i fönstret.
- Välj DLIT 3D-rekonstruktion i Tool Platte. I pulldown listan, klicka på fliken Egenskaper för att ställa vävnad egenskaper och källa spektrum. Muscle rekommenderas under de flesta förhållanden. I rullgardinsmenyn listan, klicka på Analysera på fliken för att välja våglängd för analys. Klicka på Parameter fliken och bekräfta standardvärden eller justera DLIT parametrar om det behövs. Klicka Rekonstruera flik för att starta 3D-analys.
- När 3D-rekonstruktion är klar, kommer 3D-vyn visa resultatet av 3D-rekonstruktion. Klicka på fliken Resultat se analysdata för fotonen densitet, voxlar och DLIT parametrar algoritm.
- Spara och / eller exportera resultatet av 3D-rekonstruktion analyser i siffror och datafiler.
6. Representativa resultat:
Den bioluminescence bilder av möss infekterade med självlysande bakterier tillsammans med en icke-infekterade muskontroll visas i figur 1. Mössen pulmonell infekterade med självlysande bakterier producerar viktig signal från lungorna (figur 1). Luminiscens intensitet kvantifieras som totalt inuti en ROI (region med berörda) (Figur 2). Den kvantitativa data för ljusintensitet normaliseras för kolonibildande enheter (CFU) av bakterier från lungorna för att bekräfta att signalen är framställd av den självlysande bakterier och kan jämföras med negativ kontroll. Placeringen och intensitet signalen kan analyseras ytterligare genom DLIT 3D rekonstruktion av luminiscens källan baserad på datortomografi av musen ytan 11. Dessa analyser tillåter kvantifiering och lokalisering av den producerade självlysande signalen. Resultatet av 3D-rekonstruktion av en lysande källa i infekterade möss visar att ljuset produceras från lungorna av musen (Figur 3). Den ex vivo bilder av den resulterande musen lungorna bekräfta att luminiscens avges från lungorna, snarare än något annat tätt intill varandra vävnad eller organ (figur 2C).
Figur 1. Luminiscens avbildning av pulmonell infekterade möss med självlysande bakterier taggade med CBRluc. Oinfekterade kontroll musen till vänster och två infekterade möss är till höger. Möss infekterade med bakterier som uttrycker CBRluc (n = 2) via intratrakeal rutten. 10 minuter efter luciferin injektion, var luminiscens bilder förvärvades för 10 min vid 4 positioner: rygg-, ventral, vänster och höger sida.
Figur 2. Den kvantitativa ljusintensitet från möss infekterade med bakterier uttrycka CBRluc. (A, B) Luminescence bilder av ROI-analys och de kvantifierade totala ljusflödet från ROI i rygg-och ventral positioner, respektive. Oinfekterade möss är till vänster och två infekterade möss är till höger. Luminiscens bilder förvärvades från lungorna of möss infekterade och infekterade med CBRlux (n = 2). Ljusintensiteten runt lungorna var kvantifieras av ROI-analys. C) ex vivo bilder av lungorna från infekterade (överst) och infekterade (nedtill, två uppsättningar av lungorna) möss. Luciferin injicerades 5 miniuts innan om dödshjälp och bilder förvärvades därefter. De kvantifierade värdena är normaliserat till CFU.
Figur 3. 3D-rekonstruktion av mareld källa (s) från en pulmonell infekterade mus. Musen var infekterade med bakterier som uttrycker CBRluc vid intratrakeal injektion. Den bildsekvens köptes med hjälp av olika utsläpp filter av seriella våglängder från 540 nm till 700 nm. En bildsekvens användes för 3D beredning för luminiscens källa i djurförsök som innehöll en strukturerad imag. A) tomografi för mus visas i olika lägen: framåt, bakåt, vänster och höger. Ljuskällor visas som voxlar (röda lådor inom 3D-mus) som ligger inom lunga som bestäms av återuppbyggnad. B) Photon densiy karta över uppmätta och simulerade data. Jämföra uppmätta och simulerade fotonen densitet kurvor lämna den information som kvaliteten på återuppbyggnad. Bra kvalitet rekonstruktioner resultera i liknande uppmätta och simulerade fotonen densitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även efter dessa protokoll kommer oftast resulterar i bilder av hög kvalitet är det viktigt att tänka på några viktiga frågor för att få exakta och konsekventa data från imaging studier. Luminiscens bilder bör förvärvas som räknar från 600 till 60.000 för att säkerställa att signalen ligger över bakgrunden och kameran är inte mättad. Om signal som erhålls är lägre än 600 exponeringen villkor bör justeras för att öka räknas. Om signalen erhålls är över 60.000 kameran är mättad i vissa regioner. När kameran är mättad, bör kvantifiering inte försöka i mättat regioner, även om det fortfarande är möjligt och ibland nödvändigt i icke-mättade regioner. Dessutom kan 3D-rekonstruktion inte utföras noggrant mättat ett regioner ingår i den region som används för mask för återuppbyggnaden. Justeringen av exponeringstiden kan binning och F / stopp för bild-förvärvet samt ändring av avbildning regionen eller djur lägesreglering den signal som erhålls och låt kvantitativ analys av data. Alltså i många experiment är det bra att konsekvent bild djur under flera exponeringsförhållanden för att säkerställa att minst en uppsättning bilder som kommer att vara inom de gränser som krävs för att möjliggöra kvantitativ analys.
Det är viktigt att komma ihåg att uttrycket av en reporter gen kan påverka virulens, vilket gör det nödvändigt att genomföra pilotstudier för att utvärdera eventuella effekter på fitness i rekombinanter stammar som ska användas för avbildning. Detta är en av begränsningarna med självlysande bildbehandling, eftersom det kräver uttryck av främmande gener i bakterier. Detta kan ofta lösas genom användningen av optimerade konstruktioner som använder lämpliga kodon användning för de bakteriearter som skall studeras, titrering av uttryck nivåer för reporter gener att minska påverkan på metabolism eller undersökning av flera lysande reporter system som kan skilja sig i deras inverkan på kondition.
En annan primär variabel för imaging studier med smittämnen är nivån på signalen som produceras av agenten som avbildas. Eftersom det finns skillnader i tröskeln för detektion för varje enskilt läkemedel hos djur jämfört med in vitro, är det rekommenderat att pilotstudier använder flera infektiösa doser för att optimera agent siffror innan genomföra mer omfattande experiment. Den självlysande reportrarna själva bör också vara optimerad för transkription, översättning och låg toxicitet, för att säkerställa att nivån på producerade signal är så hög som möjligt. Optimering av reportrar kan göras i de flesta fall in vitro, men ljusets våglängd utsläppsrätter kommer också att påverka möjligheten ljus som produceras av optimala reportrar att penetrera däggdjur, vilket gör det viktigt att även utvärdera olika reportrar direkt på djur. Även om varje djur kan följas individuellt, som kontrollerar en stor del av variationen mellan djur, är det fortfarande nödvändigt att inbegripa tillräcklig djur för att möjliggöra statistisk signifikans mellan grupper som skall fastställas. Vanligtvis bör antalet djur vara 4 till 6 per grupp, vilket gör att skillnader så lågt som två gånger mellan grupper som skall iakttas i många fall. Slutligen kommer inympning rutt och korrekt leverans till lämplig vävnader och av exakt agent nummer bidra till att säkerställa jämna resultat genom att minska totala variabiliteten mellan djur.
Den spektrala egenskaperna hos den producerade mareld är också en viktig faktor som påverkar förmågan att bilden infektioner in vivo. I däggdjursvävnader, är ljus av våglängder mindre än 600 nm till stor del absorberas av hemoglobin, en stor del av däggdjur. Inträngningsdjupet för mareld våglängder ökar drastiskt för våglängder som är längre än 600 nm 8,12. Både CBRluc och FFluc producera mareld med ett brett våglängd, inklusive över 600 nm, vilket gör dessa luciferases nästan perfekt reportrar för in vivo-avbildning, även i djupa vävnader inklusive lungor och lever 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Djurstudier har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges genom de institutionella Animal skötsel och användning kommitté av Texas A & M University.
Acknowledgments
Författarna tackar Cirillo laboratoriet medlemmar för värdefulla diskussioner och hjälp under hela denna studie. Vi tackar Dr Joshua Hill och laboratoriet av Dr James Samuel för hjälp med under inspelningen av detta protokoll. Detta arbete har finansierats av bidrag 48.523 från Bill & Melinda Gates Foundation och beviljar AI47866 från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| Ketamine | Butler Animal Health Supply | ||
| Xylazine | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | |
| Fetal plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Cathether (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | ||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | ||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | ||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
References
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
- Wet, J. R. de, Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
- Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
- Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).
