Summary
성인 동물 신생아 이가있는 과립 세포의 통합을 연구하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 생체내 기능 통합 확인할 수 electrophysiological 녹음 뒤에 신생아 뉴런을 라벨 설계 레트로 바이러스를 사용합니다.
Abstract
Neurogenesis은 측면 뇌실의 하위 심실 구역 (SVZ) 및 생활 전반에 걸쳐 hippocampal 이가있는 이랑의 하위 세분화된 영역 (SGZ)에 성인 포유류의 두뇌에서 발생합니다. 이전 보고서는 성인 hippocampal neurogenesis가 간질, 정신 분열증, 우울증과 불안 (1) 등 다양한 뇌 장애와 관련된 것으로 나타났습니다. 정상 및 비정상적 성인 태어난 뉴런 통합의 과정을 해독하는 것은 이러한 질병의 병인에 빛을 창고 및 새로운 치료법의 개발을 알려 수 있습니다.
SGZ 성인 neurogenesis은 운명의 사양, 마이 그 레이션, 시냅스 통합 및 성숙의 단계를 포함하여, 배아 및 사후 산후의 연결을 개발을 거울. 그러나, 전체 통합은 장기, 6 주 기간 동안 발생합니다. 성인 출생 SGZ 이가있는 과립 세포 (DGCs)에 초기 시냅스 입력을 14 일 (2)에서 glutamatergic 입력 다음, GABAergic이다. 이가있는 이랑에 성인에서 태어난 뉴런의 회로 형성을 조절하는 특정 요소는 현재 알 수 있습니다.
우리 연구실이 proliferating 세포에 형광 단백질과 가상 규제 유전자를 전달하기 위해 몰로니 murine 백혈병 바이러스에 따라 복제 - 결함 retroviral 벡터를 사용합니다. 이 바이러스 기술은 세포 생년월일, 혈통 형태, 그리고 synaptogenesis 분석에 대해 높은 특이성과 해상도를 제공합니다.
전형적인 실험은 종종 독특한 라벨, transgene, 그리고 생체내에서 원하는 개발 프로세스의 단일 세포 분석을위한 발기인 요소가 포함된 두 개 또는 세 바이러스를 고용합니다. 다음 프로토콜은 하나의 녹색 (GFP) 또는 빨간색 (dTomato) 형광 단백질 레트로 바이러스 및 패치 - 클램프 전기 생리학을 사용하여 기능성 신생아 신경 통합을 분석하는 방법을 설명합니다.
Protocol
1. 바이러스 사출
높은 titer 공학 레트로 바이러스 (1 × 10 9 단위 / ML) retroviral 벡터의 공동 transfection에 의해 생산 및 바이러스 뜨는의 ultracentrifugation 다음 HEK293T 세포로 VSVG입니다. 소스 및 생산 방법에 대한, 우수한 조브 데모 (3)을 참조하십시오.
참고 : 젊은 성인 (4-6 주를 넘어서는 안 됨) 여성 C57Bl / 6 생쥐 (찰스 리버)가 표준 조건 하에서 보관되어 있습니다. 모든 절차는 스토니 브룩 대학 IACUC 승인 프로토콜에 따라 실험실 동물 관리 및 사용을위한 국립 연구위원회의 안내를 따르십시오.
- 얼음 동물 당 냉동 레트로 바이러스의 해동의 2ul.
- 마취시키다 (100 μg의 마취제 + g 체중 당 10 μg의 xylazine)하고 stereotaxic 프레임 (Steolting)에 동물을 탑재합니다. 머리에 머리를 제거하고 70 % 에탄올로 피부를 닦아냅니다.
- 두개골을 노출 다음과 같은 지점에서 치과 드릴 (0.6mm 드릴 비트)를 사용하여 네 얕은 구멍을 드릴 :
- anterioposterior bregma에서 = -2 mm, 측면 = ± 1.6 mm, 복부 = 2.5 mm; anterioposterior bregma에서 = -3 mm, 측면 = ± 2.6 mm, 복부 = 3.2 mm.
- anterioposterior bregma에서 = -2 mm, 측면 = ± 1.6 mm, 복부 = 2.5 mm; anterioposterior bregma에서 = -3 mm, 측면 = ± 2.6 mm, 복부 = 3.2 mm.
- 1μl 해밀턴, 평면 팁 주사기를 탑재하고 이가있는 이랑에 0.25 μl / 분 속도로 사이트마다 0.5 μl 역 바이러스를 주입. 천천히 유체 역류를 방지하기 위해 주사기를 철수하기 전에 각 주입 후 (복부 깊이에 대한 위의 좌표를 참조하십시오.) 일시 정지 2 분. 주사 사이에, 간략하게 멸균 PBS로 주사기 팁 및 혈액 성분을 제거하는 작은 주걱의 외부 표면을 씻어.
- 무균 수술 봉합 재료와 상처 (타입 P - 1; 크기 6-0)을 닫고 사출 후 원하는 시간 단계까지 표준 주택 조건으로 동물을 반환합니다.
2. 슬라이스 준비
성인 생쥐에서 고품질의 급성 조각을 얻으려면, 우리는 (아래 참조) 슬라이스 준비를위한 수정 가공 솔루션을 사용합니다.
- 0-4 ° 95%와 얼음과 거품에 C O 2 -5 % 적어도 30 분 동안 CO 2 사전 진정 절단 솔루션입니다.
- 마취시키다 및 transcardially 얼음처럼 차가운 산소 포화 절삭 솔루션 동물 perfuse.
- 신속하게 필터 종이 감기, 산소 절단 솔루션으로 사전 침수와 배양 - 접시에 머리를 제거합니다. 소뇌로를 차단하고 (표시) 사출 좌표 최소 1mm의 앞쪽에 장착 표면 슬라이스. 접착제는 두뇌에 vibrotome 무대와 추위와 산소 절단 솔루션으로 가득 절삭 챔버로를 탑재합니다.
- 코로나 또는 수평 조각 (300 - 350μm)을 준비하고 룸 온도 ACSF을 포함하는 잠복기 챔버에 큰 구멍 피펫으로 그들을 전송는 95 % O 2 / 5% CO 2와 함께 부풀어 오른 모양이었다.
- 30~60분 32 ° C에서 슬라이스, 지속 버블링를 품어. 녹음 기간 동안 실내 온도에 챔버를 반환합니다.
3. Electrophysiological 실험
- 34 ° C. - 조각이 지속적으로 32 ° C에서 산소 포화 ACSF로 perfused있는 기록 챔버로 전송됩니다
- 바이폴라 텅스텐 자극 전극은 낮은 배율 현미경의 목표 (10X)를 사용하여 이가있는 이랑의 분자 층에 배치됩니다.
- 하위 세분화된 영역 / 세분화된 세포 계층의 신생아 DGCs는 GFP 또는 dTomato의 표현에 의해 식별됩니다. 전체 셀 patchclamp 녹음은 높은 배율 (40X)에서 신생아 뉴런에서 수행됩니다.
- 기록된 세포의 소성 특성 전류 클램프 모드에서 전류의 일련의 주입에 의해 얻을 수 있습니다.
- 전기 자극은 레코딩 소프트웨어에 의해 제어되는 자극의 아이 솔 레이터를 통해 자극 전극으로 전달하고, 기록하는 신생아 DGCs에서 postsynaptic 전류를 evoked있다.
4. 데이터 분석
evoked postsynaptic 응답 Amplitudes은 성인에서 태어난 뉴런의 다른 발달 단계에서 분석하고 있습니다.
5. 대표 결과
위의 프로토콜을 사용하여 그림 1과 비슷한 신생아 이가있는 이랑의 뉴런에 GFP 표현이 일반적입니다. 신생아 뉴런 쉽게 시각이며, 모두 dendrites과 axons가 견고하게 표시됩니다. 얇은 DGC axons 작은 쪽이 표현은 바이러스의 품질과 titer, 사용되는 모터와 생체내 표현의 길이에 따라 다릅니다. 우리 손에, 신생아 세포 하위 세포 organelles는 사출 다음과 같은 몇 일 이내 볼 수 있으며, 척추 표현은 개발의 초기 단계에서 추적할 수 있습니다. W다른 시간 단계에서 신생아 뉴런에서 구멍 세포 레코딩은 성숙 (그림 2B) 동안 기존의 신경 회로에 고유한 신생아 셀 속성, 예를 들어 행동 잠재력 (그림 2A),뿐만 아니라 시냅스 통합 과정의 연구를 수 있습니다.
성인 마우스의 수평 이가있는 이랑 섹션에서 신생아 뉴런의 그림 1은 2 광자 공촛점 이미지. 그린 세포가 21dpi 아르 (일 게시물 주입) GFP - 표현 pUX - GFP의 레트로 바이러스와 라벨 신생아 DGCs합니다.
그림 2) 액션 가능성 21 신생아 DGC의 속성을 발사 DPI. B)이 대표는 21 DPI에서 신생아 DGC에 기록된 흥분성의 postsynaptic 전류 (EPSCs)를 evoked.
Discussion
성인 포유류의 두뇌의 해마에서 지속 neurogenesis은 성숙한 두뇌에의 연결을 개발 및 통합을 공부하는 독특한 실험 모델 시스템을 제공합니다. 여기에 제시 프로토콜 retroviral 레이블과 성인 생쥐의 두뇌에서 신생아 이가있는 과립 뉴런의 통합을 연구 electrophysiological 방법을 결합한 제품입니다.
실험 성공되도록하기 위해, 우리는 절차의 중요한 단계 중에 다음 사항을 권장합니다 :
원치 않는 감염 및 염증을 방지하려면, 모든 도구는 수술 전에 (autoclaving, 살균기 모든 종류의, 또는 70 % 에탄올에 의해) 소독해야합니다. 주사하기 전에 주사기 바늘의 팁을 씻어 살균 PBS를 사용합니다.
바이러스 주입의 경우, 동물은 잘 stereotaxic 장치에 장착해야해야하며 불필요한 움직임의 출처는 주입하는 동안 최소화해야합니다. 머리가 잘 고정하고 기업 있는지 확인하고, 사전에 계산 사출 좌표 수준으로 bregma과 람다에 마우스의 코를 위치를 조정합니다. 객실 온도에 노출을 최소화하기 위해 신속하게 주사기로 바이러스를 추출 - retroviruses 특히 온도를 구분합니다. 압력 손상을 최소화하기 위해 권장되는 속도로 천천히 바이러스를 주사. 권장 평면 밀고 주사기 (대 일반 beveled 팁)을 사용하면 균일하게 분산 이가있는 이랑 감염 영역을 보장합니다.
조각을 준비하기 전에 솔루션을 절단하고 ACSF을 잠복기는 산소가 솔루션을 포화 수 있도록 최소 30 분 95% O 2 -5 %의 CO 2와 함께 부풀어 오른해야합니다. 동물은 빠르게 perfused 및 조직 최고의 슬라이스 품질 추위, 산소 포화 용액에 유지되어야합니다.
postsynaptic 응답이있을 때까지 녹화, 서서히 자극 강도를 향상시킬 수 있습니다. 필요한 이가있는 이랑의 분자 층 내에서 자극 전극의 위치를 변경합니다.
요약, 권장되는 접근 방법은 적극적으로, 성숙한 회로에 초기 통합하는 동안 서로 다른 특성과 성인에서 태어난 뉴런 가능한 기능 역할을 탐구하는 방법을 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NINDS와 S.Ge.로 미국 심장 협회가 후원했다 이 접근법은 원래 설립하고 존스 홉킨스 대학에서 박사 Hongjun 노래의 연구실에있는 저자에 의해 개발되었습니다. 우리는 그의지도와 지원을 위해 박사 Hongjun 노래 감사하고 싶습니다.
Materials
|
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain. Nature. 439, 589-593 (2006).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
