Summary
描述一个在成年动物的新生儿齿状颗粒细胞融合的方法来研究。该技术使用一个精心设计的逆转录病毒标签新生神经元的电生理记录，以确定在体内的功能整合。
Abstract
分侧脑室脑室区（SVZ），并在小组整个生命的海马齿状回颗粒区（SGZ），在成年哺乳动物大脑的神经再生发生。以前的报告显示，成年海马神经发生是多样的脑部疾病，包括癫痫，精神分裂症，抑郁和焦虑（1）关联。解读成人出生的正常和异常的神经元整合的过程中可能会揭示这些疾病的病因，并告知新疗法的发展。
SGZ成年神经发生反射镜胚胎和产后的神经元的发育，包括命运规范，迁移，突触的整合，和成熟的阶段。然而，全面整合多长时间，6周期间发生。初步GABA能突触输入成年出生SGZ齿状颗粒细胞（DGCs），其次是谷氨酸能在14天（2）输入。这对规范成人出生在齿状回神经元电路形成的特定因素，目前尚不得而知。
我们的实验室利用复制缺陷型逆转录病毒载体莫洛尼鼠白血病病毒的基础上，提供荧光蛋白和调控基因推测这些增殖细胞。该病毒的技术，提供高特异性细胞的出生日期，血统，形态，和突触的分析和解决。
一个典型的实验中往往采用两个或三个病毒含有独特的标签，转基因，启动子和单细胞在体内的发育过程中所需的分析。以下协议描述分析功能的新生神经元的整合，使用单一的绿色（GFP）或（dTomato）红色荧光蛋白逆转录病毒和膜片钳电生理的方法。
Protocol
1。病毒注射
高滴度工程逆转录病毒（1 × 109单位/毫升）是由逆转录病毒载体共转染HEK293T细胞，成由病毒上清离心VSVG。来源和生产方法，看到优秀的Jove示范（3）。
注：年轻成人（4-6周龄）雌性C57BL / 6小鼠（查尔斯河）是在标准条件下安置。所有的程序都遵循美国国家研究理事会的大学石溪分校IACUC批准了一项协议下的实验室动物护理和使用指南。
- 每头牲畜被冻结的逆转录病毒在冰上解冻2ul。
- 麻醉（100微克氯胺酮+每克体重10微克甲苯噻嗪）和安装在立体定位框架（Steolting）的动物。删除在头上的头发和皮肤用70％乙醇擦拭。
- 暴露的颅骨钻4个浅孔使用一个牙钻（0.6毫米钻头）在下面的坐标：
- anterioposterior = -2毫米;从囟外侧= ± 1.6毫米;腹= 2.5毫米; anterioposterior =囟-3毫米;横向= ± 2.6毫米;腹= 3.2毫米。
- anterioposterior = -2毫米;从囟外侧= ± 1.6毫米;腹= 2.5毫米; anterioposterior =囟-3毫米;横向= ± 2.6毫米;腹= 3.2毫米。
- 登上一个加入1μl汉密尔顿，平头注射器注入到齿状回率在0.25μL/ min的0.5％μL逆转录病毒网站。 （见上述腹侧深入的坐标。）暂停2分钟，每次注射后，才慢慢退出注射器，以防止流体倒流。注射之间，简单地冲洗外表面用无菌PBS的注射器针尖和撒施去除血迹。
- 关闭伤口用无菌手术缝合材料（型号P - 1型;尺寸6-0），并返回所需的时间阶段，直到注射后动物标准的住房条件。
2。切片的制备
为了获得高品质的成年小鼠急性片，我们使用切片准备修改后的切割解决方案（见下文）。
- 前寒意裁剪解决方案，以0-4 °上冰和95％的泡沫的C = O 2 -5％ 的 CO 2为至少30分钟。
- 麻醉和transcardially灌注冰冷的氧饱和切削液的动物。
- 滤纸与寒冷，含氧的切削液预湿，迅速取出培养皿盘的大脑。切断小脑和片安装表面至少1毫米前（可见光）注射坐标。胶的大脑上一个vibrotome台阶，并安装到它切割室充满了寒冷和含氧切割解决方案。
- 准备冠状或横向切片（300 -350μm）和大口径的吸管转移到孵化室含室温学联95％O 2 / 5％的CO 2气泡。
- 片，不断冒泡，在32 ° C孵育30-60分钟。返回会议厅，录音时间室温。
3。电生理实验
- 片被转移到录音室，这是连续灌注与氧饱和学联在32 ° C - 34 ° C。
- 双极型钨刺激电极放置在使用低倍率的显微镜物镜（10X）的齿状回分子层。
- 在新生儿DGCs分粒状区/颗粒细胞层表达GFP或dTomato确定。在高放大倍率（40X）下的新生神经元进行全细胞patchclamp记录。
- 射击细胞的属性得到了一系列的电流注入电流钳模式下。
- 电刺激刺激电极通过录音软件控制的刺激隔离的交付，并记录在新生儿DGCs引起突触后电流。
4。数据分析
成人出生的神经元的不同发育阶段的分析，引起突触后反应的振幅。
5。代表性的成果
使用上述协议，是常见的绿色荧光蛋白的表达在新生儿的齿状回神经元与图 1类似。请注意，新生的神经元易于可视化和强劲标记树突和轴突。在薄的DGC轴突和小刺的表达依赖于质量和滴度的病毒，促进剂，在体内表达的长度。在我们的手中，新生细胞和亚细胞器通常可见注射后几天内，脊柱的表达，可以追溯到从发展的早期阶段。 W孔在不同的时间阶段的新生神经元细胞的录音让新生细胞的独特属性，如动作电位（ 图2a），以及突触融合的过程中成熟（图2b）期间的研究到现有的神经回路。
图1 2 -光子共聚焦图像，新生神经元在一个水平的成年小鼠齿状回部分。绿色细胞21dpi（天注射后）绿色荧光蛋白表达与pUX - GFP逆转录病毒标记的新生DGCs。
图2）动作电位射击一个新生DGC的属性在21 DPI，B）代表诱发兴奋性突触后电流（EPSCs）记录在一个新生儿在21 dpi的DGC。
Discussion
连续在成年哺乳动物大脑海马神经发生提供了一个独特的实验模型系统来研究神经元的发育和成熟的大脑整合。这里介绍的协议结合逆转录病毒标签和电生理的方法来研究新生儿在成年小鼠的大脑的齿状颗粒神经元的整合。
为了确保您的实验是成功的，我们建议在整个程序的关键步骤以下内容：
为了避免不必要的感染和炎症，所有工具应消毒（高压灭菌，任何类型的消毒柜，或70％的乙醇），术前。使用无菌PBS洗注射前注射器针头的尖端。
病毒注射，动物必须要很好地安装在立体定位装置和不必要的移动源必须在注射过程中最小化。确保头是固定的和坚定的，并计算注射坐标前水平前囟和lambda调整鼠标的鼻子位置。解压缩到注射器迅速，以尽量减少暴露在室温下的病毒 - 逆转录病毒，特别是温度敏感。慢慢注入病毒在推荐率，以尽量减少压力损失。使用推荐的平头的注射器（与常见的斜面TIP）将确保一个均匀分布的齿状回感染面积。
在准备切片，切割解决方案和孵化学联必须起泡至少30分钟，让氧气饱和的解决方案，与95％Ø 2 -5％的CO 2 。动物应进行灌注和组织保持在寒冷，氧饱和片的质量为最佳的解决方案。
录音，逐渐增加刺激强度，直到有一个突触后响应。必要的齿状回内分子层变化的刺激电极的位置。
综上所述，推荐的方法提供了一种探索在早期一体化的成人出生的神经元的不同性质和可能的功能作用，转变为主动，成熟的电路。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国NINDS和美国心脏协会，以S.Ge.这种方法最初是笔者在红军宋博士在美国约翰霍普金斯大学的实验室建立和发展。我们要感谢他的指导和支持红军宋博士。
Materials
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References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain. Nature. 439, 589-593 (2006).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
