Summary
Une façon d'étudier l'intégration des nouveaux-nés des cellules granulaires denté chez les animaux adultes est décrite. Cette technique utilise un rétrovirus conçu pour étiqueter les nouveaux neurones, suivie par des enregistrements électrophysiologiques de déterminer à l'intégration fonctionnelle in vivo.
Abstract
Neurogenèse adulte se produit dans le cerveau des mammifères dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et dans la zone sous-granulaire (SGZ) du gyrus dentelé hippocampique long de la vie. Des rapports antérieurs ont montré que la neurogenèse hippocampique adulte est associée à des troubles cérébraux divers, y compris l'épilepsie, la schizophrénie, la dépression et l'anxiété (1). Décrypter le processus d'intégration des neurones normaux et aberrants pour adultes-né peut faire la lumière sur l'étiologie de ces maladies et d'informer le développement de nouvelles thérapies.
Neurogenèse adulte SGZ miroirs embryonnaire et post-natal du développement neuronal, y compris les étapes de la spécification destin, la migration, l'intégration synaptique, et la maturation. Cependant, l'intégration complète se produit sur une période prolongée, de 6 semaines période. Initial entrée synaptique à l'adulte-né cellules granulaires SGZ denté (DGCS) est GABAergique, suivie par l'entrée glutamatergique moins 14 jours (2). Les facteurs spécifiques qui réglementent formation des circuits de l'adulte-né neurones dans le gyrus denté sont actuellement inconnus.
Notre laboratoire utilise une réplication déficiente vecteur rétroviral basé sur le virus de la leucémie murine de Moloney pour livrer des protéines fluorescentes et de l'hypothèse des gènes de régulation de ces cellules proliférantes. Cette technique fournit une haute spécificité virale et la résolution pour l'analyse de la date de naissance de cellules, le lignage, la morphologie et la synaptogenèse.
Une expérience typique emploie souvent deux ou trois des virus contenant étiquette unique, transgène, et les éléments de promoteur pour analyse unicellulaire d'un processus de développement souhaité in vivo. Le protocole suivant décrit une méthode d'analyse fonctionnelle d'intégration neurone né avec un seul verte (GFP) ou rouge (dTomato) rétrovirus protéine fluorescente et de patch-clamp électrophysiologie.
Protocol
1. Injection du virus
Haute-titrage des rétrovirus modifiés (1 × 10 9 unités / ml) est produite par co-transfection des vecteurs rétroviraux et VSVG en cellules HEK293T, suivie par ultracentrifugation du surnageant viral. Pour les sources et méthodes de production, voir la démonstration JoVE excellente (3).
Remarque: Les jeunes adultes (4-6 semaines) femelle souris C57Bl / 6 (Charles River) sont logés dans des conditions standard. Toutes les procédures à suivre le Guide du Conseil national de recherches pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire selon un protocole approuvé par le IACUC l'Université Stony Brook.
- 2UL Dégel des rétrovirus gelés par animal sur la glace.
- Anesthésier (100 mg de kétamine + 10 xylazine ug par gramme de poids corporel) et monter l'animal sur un cadre stéréotaxique (Steolting). Enlever les cheveux sur la tête et essuyer la peau avec de l'éthanol à 70%.
- Exposer le crâne et percez quatre trous peu profonds à l'aide d'une fraise dentaire (0,6 mm foret) aux coordonnées suivantes:
- anterioposterior = -2 mm du bregma; latérale = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm de bregma; latérale = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm.
- anterioposterior = -2 mm du bregma; latérale = ± 1,6 mm; ventrale = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm de bregma; latérale = ± 2,6 mm; ventrale = 3,2 mm.
- Monter une Hamilton 1 microlitre, plate-bout de la seringue et injecter 0,5 rétrovirus ul par site à un taux de 0,25 l / min dans le gyrus denté. (Voir les coordonnées ci-dessus pour la profondeur ventrale.) Pause 2 minutes après chaque injection avant retirant lentement la seringue pour empêcher le retour du liquide. Entre les injections, brièvement rincer la surface externe de l'extrémité de la seringue avec du PBS stérile et un applicateur pour enlever les traces de sang.
- Fermez la plaie avec du matériel de suture chirurgical stérile (type P-1; Taille 6-0) et le retour de l'animal aux conditions de logement standard jusqu'à l'heure désirée stades après l'injection.
2. Préparation Trancher
Pour obtenir de haute qualité à partir des tranches aiguë chez la souris adulte, nous utilisons une solution de découpe modifiés pour la préparation de tranche (voir ci-dessous).
- Solution de coupe pré-froid à 0-4 ° C sur la glace et la bulle avec 95% d'O 2 -5% CO 2 pendant au moins 30 minutes.
- Anesthésier et transcardiaque perfuser un animal avec glacée saturée en oxygène solution de découpe.
- Enlever rapidement le cerveau dans une boîte de Petri avec du papier-filtre pré-mouillé avec le froid, la solution de découpe oxygénée. Couper la tranche de cervelet et une surface de montage d'au moins 1mm antérieure à l'injection de coordonnées (visibles). Collez le cerveau sur une scène vibrotome et le monter dans la chambre de coupe remplie de la solution de découpe à froid et oxygéné.
- Préparer les tranches coronales ou horizontale (300-350μm) et les transférer avec une pipette de gros calibre à une chambre d'incubation à température ambiante contenant ACSF barbotage avec 95% d'O 2 / 5% CO 2.
- Incuber les coupes, bouillonne en permanence, à 32 ° C pendant 30-60 minutes. Retour dans la chambre à température ambiante pendant la durée de l'enregistrement.
3. Des expériences électrophysiologiques
- Les tranches sont transférées dans la chambre d'enregistrement qui est perfusée en continu avec de l'oxygène saturé ACSF à 32 ° C - 34 ° C.
- Une électrode de stimulation bipolaire de tungstène est placé dans la couche moléculaire du gyrus denté en utilisant un objectif de microscope à faible grossissement (10X).
- DGCS nouveau-né dans la zone sous-granulaire / couche de cellules granulaires sont identifiés par l'expression de la GFP ou dTomato. L'enregistrement patchclamp cellule entière est effectuée sur les nouveaux neurones à fort grossissement (40x).
- Propriétés de cuisson des cellules enregistrées sont obtenues par injection d'une série de courants sous-courants pince mode.
- Stimuli électriques sont livrés par l'électrode de stimulation par l'intermédiaire d'un isolateur stimulation contrôlée par le logiciel d'enregistrement, et évoqué les courants postsynaptiques dans la DGCS-nés sont enregistrés.
4. Analyse des données
Amplitudes des réponses évoquées postsynaptiques sont analysés à différents stades de développement de l'adulte née neurones.
5. Les résultats représentatifs
En utilisant le protocole ci-dessus, l'expression de GFP dans les neurones nés gyrus denté semblable à la figure 1 est commune. Notez que les nouveaux neurones sont facilement visualisés et deux dendrites et les axones sont solidement étiquetés. Expression en fines axones GCR et de petites épines dépend de la qualité et le titre du virus, le promoteur utilisé et la longueur de l'expression in vivo. Dans nos mains, les cellules-nés et sub-cellulaire des organites sont habituellement visibles en quelques jours après l'injection, la colonne vertébrale et d'expression peut être tracée dès les premiers stades de développement. Wtrou de cellules à partir d'enregistrements nouveaux neurones à des stades différents du temps permettent l'étude des propriétés uniques de cellules nouveau-né, par exemple, des potentiels d'action (figure 2a), ainsi que le processus d'intégration synaptique dans les circuits neuronaux existants lors de la maturation (Figure 2b).
Figure 1 à 2 photons image confocale de nouveaux neurones dans une section horizontale gyrus denté d'une souris adulte. Cellules vertes sont 21dpi (jours après l'injection) exprimant la GFP DGCS nés étiquetés avec Pux-GFP rétrovirus.
Figure 2 a, b) du potentiel d'action tirs propriétés d'un nouveau-né à 21 DGC dpi.) Représentant a évoqué excitateurs courants postsynaptiques (EPSCs) enregistrées sur une GCR-né à 21 dpi.
Discussion
Neurogenèse dans l'hippocampe continue des adultes cerveau des mammifères fournit un système modèle expérimental unique pour étudier le développement et l'intégration neuronale dans le cerveau mature. Le protocole présenté ici associe l'étiquetage rétroviraux et aux méthodes électrophysiologiques pour étudier l'intégration des nouveaux-nés neurones granulaires denté dans les cerveaux de souris adultes.
Afin de s'assurer que vos expériences sont réussies, nous recommandons ce qui suit au cours des étapes critiques de la procédure:
Pour éviter l'infection et l'inflammation indésirables, tous les outils doivent être stérilisés (par autoclavage, tout type de stérilisateur, ou d'éthanol à 70%) avant la chirurgie. Utiliser du PBS stérile pour laver la pointe de l'aiguille de la seringue avant l'injection.
Pour l'injection du virus, les animaux doivent être bien monté sur le dispositif de stéréotaxie et les sources de mouvements inutiles doivent être minimisés pendant l'injection. Assurez-vous que la tête est bien fixe et ferme, et ajuster la position du nez de la souris au niveau de bregma et lambda avant l'injection du calcul des coordonnées. Extrait du virus dans la seringue rapidement pour minimiser l'exposition à des températures ambiantes - les rétrovirus sont particulièrement sensibles à la température. Injecter lentement le virus à la dose recommandée pour minimiser les dégâts de pression. Utiliser le recommande à bout plat seringue (vs commune embout biseauté) assurera une répartie secteur denté infection gyrus.
Avant de préparer les tranches, solution de découpe et l'incubation doit être ACSF barbotage avec 95% de CO 2 O 2 -5% pendant au moins 30 minutes pour permettre à l'oxygène pour saturer les solutions. Les animaux doivent être perfusés rapidement et tissus maintenus dans le froid, saturée en oxygène solution pour la meilleure qualité tranche.
Pour l'enregistrement, l'augmentation de l'intensité du stimulus progressivement jusqu'à ce qu'il y est une réponse postsynaptique. Changer l'emplacement de l'électrode de stimulation dans la couche moléculaire du gyrus denté, si nécessaire.
En résumé, l'approche recommandée offre un moyen d'explorer les propriétés distinctes et possible des rôles fonctionnels des adultes-né neurones au cours du stade précoce intégration active, circuits matures.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par NINDS et l'American Heart Association à S.Ge. Cette approche a été initialement créé et développé par l'auteur dans le laboratoire du Dr Hongjun Song à l'Université Johns Hopkins. Nous tenons à remercier le Dr Hongjun chanson pour ses conseils et de soutien.
Materials
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References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain. Nature. 439, 589-593 (2006).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
