Summary
Eine genaue Mausmodell für akute Nierenschädigung (AKI) aufgrund einer Ischämie ist ein wichtiges Instrument, um akutes Nierenversagen zu untersuchen und möglicherweise finden therapeutische Werkzeuge zur Nierenschädigung zu behandeln. Die hängende Gewicht System bietet ein Werkzeug für die sofortige und zuverlässige Nierenarterie Okklusion und Reperfusion ohne Nieren Staus.
Abstract
In hospitalisierten Patienten sind über 50% der Fälle von akutem Nierenversagen (AKI) durch renale Ischämie 1-3 verursacht. Eine aktuelle Studie der hospitalisierten Patienten ergab, dass nur eine leichte Erhöhung des Serum-Kreatinin-Spiegel (0,3 bis 0,4 mg / dl) mit einer 70% höheres Risiko für Tod, als bei Personen ohne jegliche Erhöhung 1 zugeordnet ist. Entlang dieser Linien, die eine chirurgische Verfahren cross-Klemmung der Aorta und Nierengefäße sind mit einem Nierenversagen Raten von bis zu 30% 4 zugeordnet. Ebenso tritt AKI nach herzchirurgischen Eingriffen in mehr als 10% der Patienten unter normalen Umständen und mit dramatischen Anstieg der Mortalität assoziiert. AKI sind ebenfalls häufige Komplikationen nach Lebertransplantation. Mindestens 8-17% der Patienten bis erfordern Nierenersatztherapie 5 Ende. Darüber hinaus ist verzögerter Transplantatfunktion aufgrund Tubulus Zellschädigung während der Nierentransplantation häufig Ischämie-assoziierte AKI 6 Verwandte. Darüber hinaus kommt es AKI in etwa 20% der Patienten mit Sepsis 6. Das Auftreten von AKI mit dramatischen Anstieg von Morbidität und Mortalität 1 zugeordnet ist. Therapeutische Ansätze sind sehr begrenzt und die Mehrheit der interventionellen Studien in AKI beim Menschen gescheitert. Daher sind zusätzliche therapeutische Modalitäten zur Nierenschädigung von Ischämie zu verhindern dringend 3 benötigt, 7-9.
Zur Aufklärung Mechanismen der renalen Schädigung durch Ischämie und mögliche therapeutische Strategien Mausmodellen intensiv 7-13 erforderlich. Maus-Modelle bieten die Möglichkeit der Nutzung verschiedener genetischer Modelle einschließlich Gen-Mäusen gezielt und Gewebe spezifische Gen-Mäusen gezielt (cre-flox System). Allerdings ist murine Nierenischämie technisch anspruchsvolle und experimentelle Details wesentlich beeinflussen Resultate. Wir führten eine systematische Evaluation eines neuen Modells für isolierte Nierenarterie Okklusion an Mäusen, die speziell vermeidet den Einsatz von Klammern oder Nähen der renalen Pedikel 14. Dieses Modell erfordert eine Nephrektomie der rechten Niere seit Ischämie kann nur in einer Niere durch den experimentellen Aufbau durchgeführt werden. In der Tat, mit einem hängenden Gewicht-System wird die Nierenarterie nur instrumentierte einmal während des chirurgischen Eingriffs. Darüber hinaus findet keine Venen-oder Harnröhrenobstruktion mit dieser Technik. Wir könnten Zeit-Dosis-abhängige und hoch reproduzierbare Nierenschädigung mit Ischämie zeigen, durch die Messung Serum-Kreatinin. Darüber hinaus ist beim Vergleich dieses neue Modell mit konventionellen Spannen des gesamten Pedikel-, Nieren-Schutz durch ischämische Präkonditionierung ist tiefer und zuverlässiger. Daher seine neue Technik könnte nützlich sein für andere Forscher, die auf dem Gebiet der akuten Nierenschädigung arbeiten.
Protocol
Allgemeine Bemerkungen. Alle Arbeiten sind unter einer aufrechten Präpariermikroskop (Leica) und mit Hilfe eines chirurgischen Koagulator durchgeführt werden. Die Mäuse in den experimentellen Gruppen sollten in Alter und Gewicht angepasst werden, um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Temperatur, Blutdruck, Anästhesie und Flüssigkeitszufuhr sollte stabil sein und überwacht während des Experiments.
1. Anästhesie und Chirurgie
- Nierenischämie Experimente können entweder mit gleichzeitiger Anwendung Ischämie und Reperfusion auf beide Nieren, oder nach einzelnen Nephrektomie in Kombination mit Ischämie Behandlung der verbleibenden Niere durchgeführt werden. Als bilateralen Ischämie Behandlung beider Nieren mit erhöhter technischer Schwierigkeiten, eine komplexere experimentellen Einstellung und mehr Operationen verbunden ist, führen wir ein Recht Nephrektomie durch Ischämie Behandlung der verbleibenden linken Niere durch die Verwendung eines hängenden Gewicht Systems. Wir nutzten diese hängende Gewicht System auch für die Okklusion im Herzen. Allerdings ist das Verfahren anders, da der Nierenarterie aus dem umgebenden Gewebe isoliert werden können, während der Koronararterie liegt innerhalb des Herzmuskels.
- Mäuse (8-14 Wochen alt, beiderlei Geschlechts) werden mit Pentobarbital in einer Dosierung von 70mg/kg. Wir werden Anästhesie mit ca. aufrecht zu erhalten. 10 mg / kg / h Natrium-Pentobarbital. Eine Überdosierung kann deutlich niedriger Blutdruck und kann somit die Ergebnisse verändern. In unseren ersten Studien, die wir auch Ketamin und Xylazin. Allerdings induziert diese Verbindungen eine starke Bradykardie (150 / min). Neben den beobachteten Bradykardie gibt es auch Hinweise, dass beide Verbindungen in Schutzmechanismen bei Bedingungen von Ischämie beteiligt sind. Volatile Anästhetika können weder aufgrund ihrer Fähigkeit verwendet werden, um auch induzieren renalen Schutz und niedriger Blutdruck. Deshalb sind unsere endgültige Wahl für die Anästhesie wurde Pentobarbital. Darüber hinaus sind Ketamin und Xylazin in erster Linie über die Nieren ausgeschieden. Nephrektomie und Ischämie kann zu einer Verlängerung Ketamin-Anästhesie.
- Sobald Schmerzen Reflexe fehlen (getestet, indem Sie die Zehen mit einer Pinzette) Mäuse auf einem temperierten Heiz-Tabelle platziert werden (RT, Effenberg, München, Deutschland, die Körpertemperatur bei 37,0 ° C zu halten) in eine linke Seitenlage.
- Befestigen Sie den unteren und oberen Extremitäten an den Tisch mit Klebeband.
- Für Nicht-Überleben Operationen, wie gezeigt, in der Video-Demonstration, decken den Einschnitt mit Mineralöl um das Einatmen von Maus Haare durch Schneiden der Haut zu verhindern und damit verhindern, dass die Gefahr der Maus Haare Allergien. Im Falle des Überlebens Experimente richtige aseptische Techniken einschließlich Clipping der Haare, Desinfektion der Haut mit Iodophore (zB Betadine), sterile Handhabung der Instrumente und autoklaviert Verwendung von Masken eine sterile Handschuhe für den Operateur sind erforderlich. Mineralöl ist nicht in der Überlebensrate Operationen verwendet. Für das Überleben Operationen sterile NaCl verwendet wird
- Rechte Flanke Schnitt wird mit einer Schere und einem Koagulationselektrode (Erbe, ICC50, Deutschland), um die Blutung von Muskeln und Haut Schiffe zu verhindern durchgeführt werden. Im Gegensatz zu den Zugriff auf den Nieren über Mittellinie Laparotomie, funktioniert diese Technik nicht erforderlich, den Zugang zu der Bauchhöhle.
- Die renale Pedikel einschließlich Nierenarterie und Nierenvene werden ligiert mit einem 4 / 0 Seidenfaden und die rechte Niere wird mit einer Schere geschnitten werden, ohne die Nebennieren Schiffe.
- Die Operationswunde wird geschlossen mit fortlaufenden Naht (zwei Stiche) des Muskels Wand und die Haut mit einem 4 / 0 Nahtmaterial.
- Die Tiere werden dann in einem rechten Seitenlage gelegt und eine linke Flanke Schnitt durchgeführt.
- Die linke Niere wird vorsichtig aus dem Bindegewebe entfernt, die Vermeidung der Nebenniere und Gefäße.
- Anschließend wird die Niere mit ihrer ventralen Seite nach unten in eine Lucite Tasse eingeschaltet. Die Lucite Tasse sollte für das Überleben Operationen sterilisiert werden. Der Pol der Niere wird vorsichtig in die Tasse Lucite, indem das umliegende Gewebe mit einer Pinzette geschoben. Danach wird der Pol ist vorsichtig in die Lucite Tasse mit einer Zange geschoben. Die Niere wird feucht gehalten und warm mit einem feuchten Tuch mit Wasser bei 37,0 ° C eingeweicht werden
- Nach Freilegung der linken Niere und Platzierung in einem Lucite cup der Niere Halter ist ventral um die Spannung auf die Nierengefäße sind zurückhaltend. Eine ausreichende einstweilige ist für eine erfolgreiche Platzierung der Naht unter der Nierenarterie wichtig. Danach wird die Niere Halter fixiert ist und die Nierenarterie können leicht identifiziert werden, wie es auf der Oberseite des Nierenvene verläuft.
- Die Nierenarterie ist von benachbarten Gewebe präpariert, in der Nähe seiner take-off aus der abdominalen Aorta mit feinen Pinzetten. Die Arterie wird von der zugrunde liegenden Vene mit einer gebogenen Pinzette an der Spitze abgelöst.
- Ein 8 / 0 Seidenfaden (Ethicon, Norderstedt, Deutschland) ist unter der Nierenarterie durch gesetztein Pinzette als führender Leitfaden. Diese Technik erlaubt Unterbrechung nur die arterielle Durchblutung der Niere ohne Kompression der Nierenvene, zu der renalen Pedikel Klemm verglichen.
- Die Naht wird über eine kleine Stange (kann eine vorbereitete Sicherheitsnadel werden) und einem Gewicht von ca. platziert. 1g ist an jedem Ende beigefügt (Eppendorf-Röhrchen). Das Gewicht kann auf die Niere Größe durch Weglassen und Hinzufügen von Wasser in die Eppendorf-Röhrchen angepasst werden. Allerdings sollte die Arterie leicht nach oben gezogen werden, so dass kein Blut durch die Arterie aber ohne größere Strecke auf der Arterie läuft. Große Stretch-Stress auf die Arterie kann Gefäßwandschädigung mit Verdickung der Arterienwand und reduziert Reperfusion verursachen.
- Während die Gewichte nicht unterstützt werden, ist die Nierenarterie sofort verschlossen. Im Gegensatz dazu, wenn die Gewichte unterstützt werden, wird der Blutfluss sofort an die Orgel restauriert. Erfolgreiche Okklusion wird durch eine Veränderung der Farbe von rot nach weiß bestätigt.
- Verschiedene Ischämie Zeiten kann wie durch das Experiment benötigt werden. Eine komplette Reperfusion findet je nach der Länge der Ischämie Zeit in Anspruch nehmen. Ischämie mal bis zu 45 Minuten ermöglichen erzielbaren Nierenschädigung. In unserem experimentellen Settings verwendeten wir 20 bis 30 Minuten der Ischämie mit einer mittleren Nierenschädigung, die uns zu einer Verbesserung sowie Beeinträchtigung der Nieren-Schäden in Abhängigkeit von der Maus-Stamm und der Behandlung sehen können.
- Nach vollständiger Reperfusion der Niere kann aus dem Lucite Tasse ersetzt werden. Deshalb ist die Niere Halter ist nicht fixierten und die Spannung auf die Niere wird freigegeben. Der kraniale Pol ist vorsichtig aus der Schale mit einem milden Pinzette entfernt und die kaudalen folgt unmittelbar.
- Die Fixierung (Bänder) von der Maus können freigegeben und kann die Maus in Rückenlage zB FITC-Inulin gekennzeichnet Abstand platziert werden.
- In Teilmengen von Experimenten, kann den Blutdruck und die Herzfrequenz während des chirurgischen Eingriffs erfasst werden. Blutdruckmessungen werden kontinuierlich über eine Halsschlagader Katheter erhalten. In Kürze wird die Halsschlagader über stumpfe Präparation der paratracheal Muskeln ausgesetzt. Nach weiteren Exposition und sorgfältige Vermeidung von Traumatisierung des Gewebes (insbesondere des Nervus vagus), wird ein Katheter in das Gefäß mit zwei Nähten und einer kleinen Klemme gesteckt. Der Blutdruck wird mit einem Statham-Element (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Schweiz) gemessen.
- Für FITC-markiertem Inulin-Clearance eines Katheters hat sich in der linken Halsschlagader zur Infusion von Kochsalz und FITC-markiertem Inulin platziert werden. Weiterhin ist ein Blasenkatheter muss für die Urinsammlung in einer zeitabhängigen Weise eingesetzt werden wie nachfolgend erläutert im Detail.
2. Die Messung der Nierenschädigung
- Generell gilt: Die folgenden Outcome-Parameter werden empfohlen, um Nierenschäden folgenden Nierenischämie zu bestimmen:
Führen FITC-markiertem Inulin-Clearance der glomerulären Filtrationsrate (GFR) zu beurteilen. Als Alternative einer Kreatinin-Clearance und Serum-Kreatinin über metabolischen Käfig Untersuchung 24 Stunden nach der Nierenschädigung zu bestimmen. Führen renale H & E-Färbung und eine Myeloperoxidase (MPO) ELISA zu Nierenschäden und Entzündungen von 24 Stunden nach Nierenischämie bestimmen. - Metabolic Käfig Untersuchungen:
- Nach Ischämie der linken Niere wird wieder in die retroperitoneale Lage gedreht und die Wunde geschlossen ist, wie oben beschrieben.
- Am Ende der Operation Mäuse erhalten 0,3 ml isotonischer Kochsalzlösung IP und wieder für 2 Stunden unter einer Wärmelampe.
- Danach Mäuse in metabolische Käfige (Tecniplast Deutschland, Hohenpeißenberg, Deutschland) zur Bestimmung der renalen Funktionsparameter für 2 mal 24 Stunden gestellt werden.
- Die Wasseraufnahme jeder Maus wurde durch Wiegen der leeren und gefüllten Flasche mit Wasser vor der Auslieferung an die Maus und als bestimmt 24 Stunden später werden durch Wiegen der vollen Flasche wieder. Die Maus Gewicht hat als gut bestimmt werden.
- Nach 24 Stunden ca. 75μl Blut aus dem Venenplexus hinter dem Auge über eine Kapillare unter kurzer Vollnarkose isoflorane genommen.
- Die Nierenfunktion wird durch die Messung Plasma-und Urin-Kreatinin 24 Stunden nach renalen Ischämien mit einem handelsüblichen colorimtric Methode nach Angaben des Herstellers `s Protokoll (LT-SYS, Labor + Technik, Berlin, Deutschland) untersucht. Plasma und Urin-Konzentrationen von Na +, K + werden mit einem Flammen-Emissions-Photometer (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) bestimmt. Renal Ausscheidungsorgane und hämodynamischen Werte berechnet unter Verwendung von Standard Formeln 15-17.
- Inulin-Clearance: FITC-Inulin-Clearance Experimente werden folgende renale Ischämie durchgeführt werden.
- Die linke Halsschlagader ist für die kontinuierliche i kanüliertennfusion. Nach Zerlegung der Vene aus benachbartem Gewebe mit einer Zubereitung Schere (Dumont, WPI) Platz zwei Nähten (4 / 0) rund um die Vene. Legen Sie eine Klemme an der Vene vor der proximale Naht um den Blutfluss zu stoppen. Danach schließen Sie das distale Knoten und ein Gewicht an einem der distalen Fadenenden um die Spannung auf die Vene Belastung. Dies ist sehr wichtig, um den Katheter in die Vene zu bekommen. Verwenden Sie einen Mikro-Schere, eine kleine Öffnung in die Richtung gesägt. Halten Sie die Öffnung mit einer feinen Pinzette (Dumont, WPI) und platzieren Sie den Katheter in die Vene. Um vorab den Katheter nehmen die Klemme. Stellen Sie sicher, dass es keine Spannung auf den Katheter, so dass Sie es kann sich, ohne es. Danach schließen Sie das zweite proximale Naht über die Vene und der Katheter.
- Ein Katheter wird in die Harnblase für zeitgesteuerte Urinsammlung platziert. Deshalb schneidet man einen kurzen Schnitt in der Haut über der Blase. Entfernen Sie vorsichtig die Blase durch die Haut Loch. Fix die Blase mit einem feuchten Tuch. Legen Sie eine vorbereitete Naht über der Blase (4 / 0).
- Schneiden Sie ein kurzes Stück eines Katheters (1,5 cm) und Wärme auf Ende an einem Ring um den Katheter, die es einfacher, sie in die Blase zu beheben macht bekommen.
- Schneiden Sie ein Loch in die Blase an ihrer Spitze. Machen Sie den Schnitt zwischen den Gefäßen zu Blutungen zu verhindern. Legen Sie das große Ende des Katheters in die Blase, und schließen Sie die Naht über den Katheter und die Blase.
- Alle Mäuse erhalten ein Bolus von 0,85% Natriumchlorid-Lösung in einer Höhe von 20% des Körpergewichts. Kontinuierliche Infusion mit einer Rate von 800ul/h/25g Körpergewicht und FITC-Inulin ist die Infusion für die Bewertung der gesamten Niere glomerulären Filtrationsrate (GFR) hinzugefügt gepflegt. Nach der Stabilisierung der Tiere für 20 min, 20 min timed Urin Sammlungen durchgeführt (viermal) zur Bestimmung der Harnflussrate und FITC-Inulin. Blut ist in der Mitte jeder Periode zur Messung von FITC-Inulin erhalten.
- Beim Start der Sammlung Zeiten für 20 Minuten einen Timer. Sammeln Sie den Urin, indem das Ende der Blasenkatheter in eine kleine Eppendorf-Röhrchen. Messen Sie den Schlauch Gewicht vor und nach der Urinsammlung, so dass Sie den Urin Menge zu bestimmen. Die Blutproben werden über retroorbitalen Blutentnahme bilden die Venenplexus über Kapillaren in der Mitte eines jeden Erhebungszeitraum genommen.
- Blut und die Niere kann nach jedem Verfahren zur weiteren Analyse zB MPO ELISA, Zytokin EISA, Histologie gesammelt werden.
3. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1 Modell einer hängenden Gewicht für renale Ischämie:. Ein hängendes Gewicht System wurde eingerichtet, um Nierenischämie der linken Niere zu induzieren. Deshalb ein 8,0 Nylonnaht wurde unter der Nierenarterie platziert und am Ende jedes Fadens ein kleines Gewicht (1g) angebracht wurde. Dieses experimentelle Design erlaubt reversible Okklusion der Nierenarterie durch Be-und Entlastung der Gewichtsbelastung.
Discussion
Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Studie eine neuartige Technik für die Durchführung Nierenischämie in einem Mausmodell mit einem hängenden Gewicht für Nierenarterie Okklusion. In der Tat zeigt diese Studie sehr gut reproduzierbare Verletzungen und minimiert so die Variabilität mit Klemmung der renalen Pedikel verbunden.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die vorliegenden Untersuchungen wurden von der United States National Institutes of Health gewähren R01-HL092188, R01-DK083385 und R01HL098294 und Stiftung für Anästhesie Bildung und Forschung (faer) Zuschüsse an HKE, ein faer gewähren JYD und DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Forschung unterstützt Fellowship (GR2121/1-1) bis AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | World Precision Instruments, Inc. | a fine microvessel scissor |
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