Summary
Un preciso modello murino di danno renale acuto (AKI) a causa di ischemia è uno strumento importante per indagare danno renale acuto e, eventualmente, trovare strumenti terapeutici per il trattamento di lesioni renali. Il sistema di peso appeso offre uno strumento di immediata e affidabile occlusione dell'arteria renale e la riperfusione senza causare la congestione renale.
Abstract
In pazienti ospedalizzati, oltre il 50% dei casi di danno renale acuto (AKI) sono causati da ischemia renale 1-3. Un recente studio di pazienti ricoverati in ospedale hanno rivelato che solo un lieve aumento dei livelli di creatinina sierica (0,3 a 0,4 mg / dl) è associato ad un rischio superiore del 70% di morte rispetto a persone senza alcun aumento 1. Lungo queste linee, le procedure chirurgiche che richiedono cross-clamp dell'aorta e dei vasi renali sono associati con un tasso di insufficienza renale fino al 30% 4. Allo stesso modo, AKI dopo chirurgia cardiaca si verifica in oltre il 10% dei pazienti in circostanze normali, ed è associata ad un aumento drammatico della mortalità. AKI sono anche complicazioni comuni dopo trapianto di fegato. Almeno il 8-17% dei pazienti finiscono per richiedere terapia di sostituzione renale 5. Inoltre, funzioni dell'organo trapiantato a causa di lesioni tubulo cellulare durante il trapianto di rene è spesso legate all'ischemia associati AKI 6. Inoltre, AKI si verifica in circa il 20% dei pazienti affetti da sepsi 6. La comparsa di danno renale acuto è associato ad un aumento drammatico di morbilità e mortalità 1. Approcci terapeutici sono molto limitati e la maggior parte delle prove interventistica in AKI hanno fallito negli esseri umani. Pertanto, ulteriori modalità terapeutiche per prevenire il danno renale da ischemia sono urgentemente necessari 3, 7-9.
Per chiarire i meccanismi di danno renale a causa di ischemia e le possibili strategie terapeutiche modelli murini sono intensamente necessari 7-13. Modelli murini di fornire la possibilità di utilizzare differenti modelli genetici tra cui geni mirati topi e tessuti specifici geni bersaglio topi (CRE-flox sistema). Tuttavia, murino di ischemia renale è tecnicamente impegnativa e dettagli sperimentali significativamente influenzare i risultati. Abbiamo effettuato una valutazione sistematica di un modello innovativo per isolato occlusione dell'arteria renale nei topi, che evita specificamente l'uso di bloccaggio o di sutura dei 14 peduncolo renale. Questo modello richiede un nefrectomia del rene destro da quando l'ischemia può essere eseguita solo in un rene a causa dell'impostazione sperimentale. Infatti, utilizzando un sistema di sospensione di peso, l'arteria renale è solo strumentato una volta tutta la procedura chirurgica. Inoltre, nessuna ostruzione venosa o uretrale si verifica con questa tecnica. Potremmo dimostrare tempo-dose-dipendente e altamente riproducibile danno renale con ischemia attraverso la misurazione della creatinina sierica. Inoltre, confrontando questo nuovo modello con bloccaggio convenzionale di tutto il peduncolo, la protezione renale da precondizionamento ischemico è più profonda e più affidabile. Quindi la sua nuova tecnica potrebbe essere utile per altri ricercatori che stanno lavorando nel settore del danno renale acuto.
Protocol
Osservazioni generali. Tutte le operazioni devono essere eseguite con un microscopio verticale dissezione (Leica) e utilizzando un coagulatore chirurgico. I topi nei gruppi sperimentali devono essere abbinati per età e peso per garantire la comparabilità dei risultati. Amministrazione di temperatura, pressione arteriosa, anestesia e fluido deve essere stabile e monitorato durante l'esperimento.
1. Anestesia e chirurgia
- Esperimenti di ischemia renale può essere eseguita con simultanea di ischemia e riperfusione a entrambi i reni, o dopo nefrectomia singolo in combinazione con il trattamento ischemia del rene residuo. Poiché il trattamento ischemia bilaterale di entrambi i reni è associata ad un aumento delle difficoltà tecniche, uno scenario più complesso e più lungo intervento chirurgico sperimentale, verrà effettuata una nefrectomia destra seguita da una terapia ischemia del rene residuo lasciato utilizzando un sistema di pesi appesi. Abbiamo utilizzato questo sistema peso appeso anche per occlusione coronarica nel cuore. Tuttavia, la procedura è diversa in quanto l'arteria renale può essere isolato dal tessuto circostante, mentre l'arteria coronaria si trova all'interno del muscolo cardiaco.
- Topi (8-14 settimane di età, entrambi i sessi) saranno anestetizzati con pentobarbital ad una dose di 70mg/kg. Manterremo l'anestesia con ca. 10 mg / kg / h di sodio pentobarbital. Sovradosaggio può ridurre significativamente la pressione sanguigna e quindi possono alterare i risultati. Nei nostri studi iniziali abbiamo usato anche ketamina e xilazina. Tuttavia, questi composti ha indotto un forte bradicardia (150 / min). Accanto alla bradicardia osservato vi sono anche prove che entrambi i composti sono coinvolti nei meccanismi di protezione in condizioni di ischemia. Anestetici volatili non possono essere utilizzati sia per la loro capacità di indurre anche la protezione renale e la pressione sanguigna bassa. Quindi la nostra scelta finale per l'anestesia è stata pentobarbital. Inoltre, ketamina e xilazina sono escreti principalmente dai reni. Nefrectomia e ischemia può prolungare l'anestesia ketamina.
- Una volta che il dolore riflessi sono assenti (testato premendo le dita dei piedi con le pinzette) topi sarà posto su un tavolo a temperatura controllata riscaldamento (RT, Effenberg, Monaco di Baviera, in Germania per mantenere la temperatura corporea a 37,0 ° C) in decubito laterale sinistro.
- Fissare le estremità inferiori e superiori alla tabella utilizzando del nastro adesivo.
- Per i non-sopravvivenza interventi chirurgici, come mostrato nel video dimostrativo, coprire l'area incisione con olio minerale per evitare l'inalazione di capelli mouse tagliare la pelle e quindi prevenire il rischio di allergie capelli mouse. In caso di esperimenti di sopravvivenza corrette tecniche asettiche compresi ritaglio di capelli, la disinfezione della pelle con iodofori (es. Betadine), la gestione di strumenti sterili e in autoclave utilizzando le maschere di uno guanti sterili per il chirurgo sono obbligatori. Olio minerale non viene utilizzato in interventi chirurgici sopravvivenza. Per la chirurgia sopravvivenza sterile NaCl viene usato
- Incisione fianco destro sarà effettuato con una forbice e un elettrodo di coagulazione (Erbe, ICC50, Germania) per prevenire le emorragie dei muscoli e dei vasi della pelle. In contrasto con l'accesso ai reni tramite laparotomia mediana, questa tecnica non richiede l'accesso alla cavità peritoneale.
- Il peduncolo renale compresi dell'arteria renale e la vena renale sono legatura con una sutura 4 / 0 in seta e il rene destro verrà tagliata con una forbice senza interferire con i vasi surrenali.
- La ferita chirurgica viene chiusa con sutura continua (due punti) della parete muscolare e la pelle con un 4 / 0 sutura.
- Gli animali vengono poi poste in una posizione di decubito laterale destro e un incisione fianco sinistro verrà eseguita.
- Il rene sinistro viene accuratamente rimossa dal tessuto connettivo, evitando la ghiandola surrenale e dei vasi.
- Successivamente, il rene è rivolto con il lato ventrale verso il basso in una tazza lucite. La coppa lucite devono essere sterilizzati per interventi chirurgici sopravvivenza. Il polo del rene è attentamente spinto nella tazza lucite tenendo premuto il tessuto circostante con una pinza. Da allora in poi il palo viene accuratamente spinto nella tazza Lucite con una pinza. Il rene saranno conservati umido e caldo con un tampone imbevuto bagnato con acqua a 37,0 ° C.
- Dopo l'esposizione del rene sinistro e il posizionamento in una tazza lucite titolare rene è trattenuto ventralmente soffre di tensione sui vasi renali. Un contenimento sufficiente è importante per un posizionamento di successo della sutura sotto l'arteria renale. Successivamente il titolare del rene è fissa e l'arteria renale può essere facilmente identificato come corre in cima alla vena renale.
- L'arteria renale viene sezionato dai tessuti adiacenti, vicino al suo decollo dalla aorta addominale con una pinza sottile. L'arteria è sezionato dalla vena sottostante con una pinza curva in cima.
- Una sutura 8 / 0 seta (Ethicon, Norderstedt, Germania) è posto sotto l'arteria renale, utilizzandouno pinze come guida principale. Questa tecnica permette solo l'interruzione del flusso di sangue arterioso al rene senza compressione della vena renale, rispetto alla chiusura del peduncolo renale.
- La sutura è posto sopra un palo di piccole dimensioni (può essere preparata una spilla da balia) e un peso di ca. 1g è collegato a ogni estremità (tubo eppendorf). Il peso può essere adattato alle dimensioni del rene da togliere o aggiungere acqua nei tubi Eppendorf. Tuttavia, l'arteria dovrebbe essere leggermente tirato verso l'alto, in modo che il sangue non è in esecuzione attraverso l'arteria, ma senza allungare importante sulla arteria. Lo stress maggiore sul tratto l'arteria può causare danni ai vasi a parete con ispessimento della parete arteriosa e riperfusione ridotta.
- Mentre i pesi sono supportati, l'arteria renale è immediatamente occluso. Al contrario, quando i pesi sono supportate, il flusso di sangue viene immediatamente ripristinata l'organo. Occlusione di successo è confermato da un cambiamento di colore dal rosso al bianco.
- Tempi di ischemia diversi può essere eseguito come previsto dalla sperimentazione. Un riperfusione completa si terrà a seconda della lunghezza del tempo di ischemia. Tempi di ischemia fino a 45 minuti permettere recuperabile lesioni renali. Nel nostro impostazioni sperimentali abbiamo utilizzato 20 fino a 30 minuti di ischemia con una ferita medio renale che ci permette di vedere un miglioramento così come riduzione di valore del danno renale a seconda del ceppo del mouse e il trattamento.
- Dopo riperfusione completa del rene può essere sostituito dalla coppa lucite. Quindi il titolare del rene è non fissata e la tensione sul rene viene rilasciato. Il polo craniale viene delicatamente rimosso dalla coppa con una pinza blando e il polo caudale segue immediatamente.
- La fissazione (nastri) del mouse può essere rilasciato e il mouse può essere collocato in posizione supina per esempio FITC inulina distanza etichettati.
- In sottoinsiemi di esperimenti, la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca possono essere registrati durante tutta la procedura chirurgica. Misurazione della pressione del sangue si ottengono in continuo tramite un catetere in arteria carotide. In breve, l'arteria carotidea è esposta tramite dissezione dei muscoli paratracheali. A seguito di evitare ulteriore esposizione e attenta di traumi dei tessuti (in particolare del nervo vagale), un catetere viene inserito nel vaso con due punti di sutura e una pinza di piccole dimensioni. La pressione sanguigna è misurata con un elemento Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Svizzera).
- Per marcato con FITC spazio inulina un catetere deve essere posizionato nella vena giugulare sinistra per infusione di cloruro di sodio e di inulina coniugati con fluoresceina. Inoltre un catetere vescicale deve essere inserito per la raccolta delle urine in modo dipendente dal tempo come spiegato di seguito in dettaglio.
2. Misurazione del danno renale
- In generale: i parametri di risultato sono consigliati i seguenti per determinare il danno renale dopo ischemia renale:
Eseguire marcato con FITC distanza di inulina per valutare la velocità di filtrazione glomerulare (GFR). In alternativa determinare la clearance della creatinina e la creatinina sierica mediante indagine gabbia metabolica 24 ore successive danno renale. Eseguire renale colorazione H & E e un mieloperossidasi (MPO) ELISA per determinare danno renale e infiammazione 24 ore dopo ischemia renale. - Indagini gabbia metabolica:
- A seguito di ischemia del rene sinistro è tornato indietro nella posizione retroperitoneale e la ferita è chiuso come sopra descritto.
- Alla fine della chirurgia topi ricevere 0,3 ml di soluzione fisiologica IP e recuperare per 2 ore sotto una lampada di riscaldamento.
- In seguito i topi saranno collocati in gabbie metaboliche (Tecniplast Deutschland, Hohenpeißenberg, Germania) per la determinazione dei parametri di funzionalità renale, per 2 volte di 24 ore.
- La presa d'acqua di ogni mouse deve essere determinata pesando la bottiglia vuota e piena d'acqua prima della fornitura al mouse e di 24 ore dopo pesando la bottiglia di nuovo piena. Il peso del mouse deve essere determinato come bene.
- Dopo 24 ore circa 75μl di sangue sono prese dal plesso venoso dietro l'occhio attraverso un tubo capillare in anestesia isoflorane breve.
- La funzione renale è valutata misurando la creatinina plasmatica e urine delle 24 ore dopo l'ischemia renale, utilizzando un metodo disponibile in commercio colorimtric secondo il costruttore `s protocollo (LT-SYS, Lavoro + Technik, Berlino, Germania). Concentrazioni plasmatiche e nelle urine di Na +, K + vengono determinate con un emissione di fiamma fotometro (ELEX 6361, Eppendorf AG, Amburgo, Germania). Escretoria renale e valori emodinamici vengono calcolati utilizzando formule standard 15-17.
- La clearance inulina: FITC-inulina esperimenti spazio sarà eseguita dopo l'ischemia renale.
- La vena giugulare sinistra è cannulata di continuo infusion. Dopo sezionare la vena da tessuti adiacenti con una forbice preparazione (Dumont, WPI) inserire due punti di sutura (4 / 0) attorno alla vena. Inserire una fascetta sulla vena prima della sutura proximale per fermare il flusso di sangue. Successivamente, chiudere il nodo distale e posto un peso su una delle estremità distali sutura per la tensione la tensione sulla vena. Questo è molto importante per ottenere il catetere nella vena. Utilizzare un micro-forbice per tagliare una piccola apertura nella vena. Tenere l'apertura con una pinza sottile (Dumont, WPI) e posizionare il catetere nella vena. Per far avanzare il catetere prendere il morsetto off. Assicurarsi che non vi sia tensione sul catetere in modo che possiate metterlo giù senza tenerlo. Successivamente, chiudere la seconda sutura prossimale sopra la vena e il catetere.
- Un catetere viene inserito nella vescica urinaria per la raccolta delle urine a tempo. Quindi si taglia una breve incisione nella pelle sopra la vescica. Rimuovere con attenzione la vescica attraverso il foro della pelle. Fissare la vescica con un panno bagnato. Inserire una sutura preparato oltre la vescica (4 / 0).
- Tagliare un pezzo breve di un catetere (1.5cm) e riscaldare fine di ottenere un anello intorno al catetere che rende più facile per risolvere il problema nella vescica.
- Praticare un foro nella vescica al suo top. Eseguire il taglio tra i vasi per prevenire le emorragie. Inserire l'estremità grande del catetere nella vescica e chiudere la sutura sopra il catetere e la vescica.
- Tutti i topi ricevere un bolo di soluzione di cloruro di sodio 0,85% per un importo pari al 20% del peso corporeo. L'infusione continua è mantenuta ad un tasso di 800ul/h/25g peso corporeo e FITC-inulina è aggiunto l'infusione per la valutazione di tutta la velocità di filtrazione glomerulare renale (GFR). Dopo la stabilizzazione degli animali per 20 min, 20 min collezioni delle urine sono eseguiti a tempo (quattro volte) per la determinazione della velocità del flusso urinario e FITC-inulina. Sangue si ottiene nel mezzo di ogni epoca per la misurazione di FITC-inulina.
- Quando si avvia il periodo di raccolta per 20 minuti utilizzare un timer. Raccogliere le urine mettendo alla fine del catetere vescicale in un piccolo tubo eppendorf. Misurare il peso del tubo prima e dopo la raccolta delle urine in modo che sia possibile determinare la quantità di urina. I campioni di sangue sono prese attraverso il modulo retroorbital raccolta del sangue del plesso venoso attraverso tubi capillari nel mezzo di ciascun periodo di raccolta.
- Sangue e del rene possono essere raccolte dopo ogni procedura per l'ulteriore analisi ELISA MPO per esempio, citochine EISA, istologia.
3. Rappresentante dei risultati:
Figura 1 Modello di un sistema pensile-peso per ischemia renale:. Un sistema di peso appeso è stato istituito per indurre ischemia renale del rene sinistro. Quindi un 8,0 sutura in nylon è stato posto sotto l'arteria renale e alla fine di ogni sutura un piccolo peso (1g) è stato attaccato. Questo disegno sperimentale consente reversibile occlusione dell'arteria renale, applicando e rilasciando il peso del carico.
Discussion
In sintesi, il presente studio descrive una nuova tecnica per l'esecuzione di ischemia renale in un modello murino utilizzando un sistema di sospensione di peso per occlusione dell'arteria renale. In realtà, questo studio dimostra lesioni altamente riproducibili, minimizzando così la variabilità associata a bloccaggio del peduncolo renale.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli studi attuali sono stati sostenuti da United States National Institutes of Health-HL092188 concedere R01, R01-DK083385 e R01HL098294, e la Fondazione per l'educazione Anestesia e della Ricerca (FAER) Borse di HKE, una borsa di studio per FAER jyà e un (Deutsche Forschungsgemeinschaft) DFG ricerca Fellowship (GR2121/1-1) di AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | World Precision Instruments, Inc. | a fine microvessel scissor |
References
- Abuelo, J. G. Normotensive ischemic acute renal failure. N Engl J Med. 357, 797-805 (2007).
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 448-460 (1996).
- Lameire, N. The pathophysiology of acute renal failure. Crit Care Clin. 21, 197-210 (2005).
- Gelman, S. The pathophysiology of aortic cross-clamping and unclamping. Anesthesiology. 82, 1026-1060 (1995).
- Yalavarthy, R., Edelstein, C. L., Teitelbaum, I. Acute renal failure and chronic kidney disease following liver transplantation. Hemodial Int. 11, Suppl 3. S7-S12 (2007).
- Schrier, R. W., Wang, W. Acute renal failure and sepsis. N Engl J Med. 351, 159-169 (2004).
- Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T. The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia. PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).
- Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M. Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).
- Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T. Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia. J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).
- Akcay, A., Nguyen, Q., Edelstein, C. L. Mediators of inflammation in acute kidney injury. Mediators Inflamm. , 137072-137072 (2009).
- Faubel, S., Ljubanovic, D., Poole, B. Peripheral CD4 T-cell depletion is not sufficient to prevent ischemic acute renal failure. Transplantation. 80, 643-649 (2005).
- Wei, Q., Bhatt, K., He, H. Z., Mi, Q. S., Haase, V. H., Dong, Z. Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 21, 756-761 (2010).
- Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors. Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).
- Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).
- Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).
